2019 Fiscal Year Research-status Report

DOT1L阻害による多発性骨髄腫の新規治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	19K17836
Research Institution	Sapporo Medical University
Principal Investigator	石黒一也札幌医科大学, 医学部, 訪問研究員 (90784439)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2021-03-31
Keywords	多発性骨髄腫 / ヒストンメチル化
Outline of Annual Research Achievements	多発性骨髄腫は予後不良な疾患であり、新規治療薬の探索が必要である。ヒストンメチル化修飾の異常は様々ながんの発生や進展に関与するが、多発性骨髄腫における知見は十分ではない。我々はヒストンメチル化酵素であるDOT1Lの阻害が、IRF4-MYCシグナルを抑制することで骨髄腫細胞の増殖を抑制することを明らかにした。本研究はDOT1L阻害の作用機序をさらに解明し、臨床応用につなげることを目指した。我々はまず、多発性骨髄腫において、DOT1Lの阻害が免疫反応を上昇させることに着目した。理由としては、近年多発性骨髄腫において、thalidomide、lenalidomide、pomalidomideといった免疫調節薬やelotuzumab、daratumumabといった抗体製剤など、免疫を標的とした治療が主流であり、一定の治療効果を示しているからである。我々はDOT1Lの阻害が免疫反応を上昇させる機序の一つとして、内在性レトロウイルスの再活性を見出した。さらに他のヒストンメチル化修飾にも着目し、ヒストンH3リジン27メチル化酵素とヒストンH3リジン9メチル化酵素の阻害も免疫反応を上昇させることを見出した。DOT1Lの阻害による抗腫瘍効果にも免疫反応は大変重要であると考えられたことから、我々は他の2種類のヒストンメチル化修飾酵素にも着目し、DOT1Lとの関連も含め、統合的に解析を行っていくこととした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 近年、DNAメチル化酵素阻害剤などのエピジェネティック阻害剤により、内在性レトロウイルスが再活性化され、免疫反応が上昇し、抗腫瘍効果を呈するという報告が散見され、我々も骨髄腫細胞株でDOT1Lを阻害し、定量RT-PCRで内在性レトロウイルスの発現の変化を確認した。その結果、多くの骨髄腫細胞株で、DOT1Lの阻害により、内在性レトロウイルスの発現が上昇していることが確認され、免疫反応の上昇の機序の一つと考えられた。一方で我々は、ヒストンH3リジン27メチル化酵素の阻害と、ヒストンH3リジン9メチル化酵素の阻害も、DOT1Lの阻害程強くはないが、骨髄腫細胞の増殖を抑制することを細胞増殖アッセイで確認した。また、ヒストンH3リジン27メチル化酵素とヒストンH3リジン9メチル化酵素両者の阻害が、相加的に骨髄腫細胞の増殖を抑制することを見出した。さらにフローサイトメトリー解析で、両酵素の阻害が骨髄腫細胞に細胞周期停止を誘導し、アポトーシスを引き起こし、細胞増殖を抑制することを確認した。次に我々は、両酵素を阻害した骨髄腫細胞を用いて、マイクロアレイアレイによる網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、両酵素の阻害により免疫反応が有意に上昇していることが分かった。一方、両酵素の阻害により、DOT1L阻害の際と同様に、IRF4-MYCシグナルも抑制されていることが明らかとなった。IRF4-MYCシグナルは免疫反応にリンクしていると考えられ、ヒストンH3リジン27メチル化酵素とヒストンH3リジン9メチル化酵素は、DOT1Lと相互作用している可能性が示唆された。
Strategy for Future Research Activity	今後は、DOT1L、ヒストンH3リジン27メチル化酵素、ヒストンH3リジン9メチル化酵素の阻害による免疫反応の上昇の機序を明らかにするために、それぞれのヒストンメチル化修飾に対するクロマチン免疫沈降シークエンス解析を行い、遺伝子発現の変化とヒストンメチル化修飾の変化の統合的な解析を行い、DOT1L、ヒストンH3リジン27メチル化酵素、ヒストンH3リジン9メチル化酵素間の相互作用を明らかにする。またDOT1LとヒストンH3リジン27メチル化酵素の阻害、あるいはDOT1LとヒストンH3リジン9メチル化酵素の阻害、さらに三者の阻害で、抗骨髄腫効果に相加的な作用がないか、細胞増殖アッセイで確認する。さらに、thalidomide、lenalidomide、pomalidomideといった免疫調節薬との併用で、相乗効果がないか細胞増殖アッセイで評価する。一方で、DOT1L阻害自体の作用機序をさらに解明するために、shRNAライブラリスクリーニングを行い、DOT1L阻害への抵抗性メカニズムを明らかにし、また前臨床試験として、in vivoマウスモデルを用いてDOT1L阻害剤の持続投与による抗骨髄腫効果を明らかにする。
Causes of Carryover	2019年度にクロマチン免疫沈降シークエンスを行う予定であったが、クロマチン免疫沈降の条件検討に時間を要したため行うことができず、次年度使用額が生じた。 2020年度はこのクロマチン免疫沈降シークエンスに加え、大きな実験としては、shRNAライブラリスクリーニング、in vivoマウスモデル実験を行う予定である。また研究成果を論文にまとめ、投稿する予定である。