マントル細胞リンパ腫におけるmir17-92クラスターの網羅的機能解析と治療開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K17867
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 塚本 拓 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50825049)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: マントル細胞リンパ腫 / B細胞受容体シグナル / mir-17~92 cluster

Outline of Annual Research Achievements

マントル細胞リンパ腫(MCL)の発生母地であるナイーブB細胞では、通常、B細胞受容体(BCR)シグナル経路の活性は低いのに対し、MCLではBCRシグナル活性の過剰活性化が認められる。これまでMCLにおけるBCR活性化機序は未解明であったが、micro RNAであるmir-17~92 clusterの高発現がその原因となる可能性がある。本研究ではmir-17~92 clusterの網羅的標的探索を通じてMCL特異的なBCRシグナル活性化の分子メカニズムを解明し、その知見に基づいた新規BCRシグナル標的療法の開発を目的として研究をおこなっている。
検討した5種類のMCL細胞株全てで、mir-17~92 cluster構成micro RNAの発現が正常Bリンパ球に比べて上昇していることを確認した。mir-17~92のアンチセンスオリゴを用いた阻害による標的RNAの定量PCRにてmir-17~92 clusterの標的分子の同定を試みたが、転写産物レベルでのアッセイは感度が低いことが明らかになった。
またmir-17~92 clusterの発現調節因子としてMCLで過剰発現している転写因子であるSOX11の機能を調べるため、shRNAを用いたノックダウン実験を進めている。
更にBCRシグナル阻害薬であるibrutinib耐性細胞株を作出するとともに、CRISPR screeningにより網羅的にIbrutinib耐性に関与する遺伝子を探索することで、多角的にMCLにおけるBCRシグナル活性化機序の解明を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の重要なステップであるmir-17~92 clusterの網羅的標的分子の同定において、当初はアンチセンスオリゴを用いたmiRNA阻害を介した標的RNAの探索を試みていたが、転写産物レベルでのアッセイ(マイクロアレイもしくは通常のRNA-Seq)は感度が低いことが明らかになった。そのためより直接的にmir-17~92 clusterの標的を探索するため、ビオチン標識miRNAを用いたPulldown-Seq技術による検証を行うこととした。現在、実験条件の検討作業はほぼ終了し、シーケンス実験の準備がほぼ整っている

Strategy for Future Research Activity

Pulldown-Seqによるmir-17~92 clusterの標的同定実験とその解析を進めていく。BCRシグナル関連mir-17~92 cluster被制御分子として同定された分子に関し、MCL細胞株においてCRISPR/Cas9による遺伝子編集を実施し、細胞生物学的効果、BCRシグナル制御能について検討し、最も抗腫瘍効果の高い分子を治療標的候補分子として選択する。またMCL診断時保存検体において、免疫組織化学、real-time PCR、ウエスタンブロット等で発現、活性について解析し臨床的意義を明らかにする。
上記で同定されたmir-17~92 clusterの標的分子それぞれについて、その制御によってBTK阻害剤耐性が克服できるか、ibrutinib耐性細胞株を用いて検証し、BTK阻害剤抵抗性克服能を有する標的分子を特定する。

Causes of Carryover

当初予定していた旅費が不要となったため、次年度に繰り越して使用を予定している。

Research Products

• [Journal Article] BRD4-Regulated Molecular Targets in Mantle Cell Lymphoma: Insights into Targeted Therapeutic Approach. (2020)
  • Author(s): Tsukamoto T, Nakahata S, Sato R, Kanai A, Nakano M, Chinen Y, Maegawa-Matsui S, Matsumura-Kimoto Y, Takimoto-Shimomura T, Mizuno Y, Kuwahara-Ota S, Kawaji Y, Taniwaki M, Inaba T, Tashiro K, Morishita K, Kuroda J
  • Journal Title: Cancer Genomics Proteomics Volume: 17 Pages: 77-89
  • DOI: 10.21873
  • Peer Reviewed / Open Access