2019 Fiscal Year Research-status Report
バンコマイシン耐性腸球菌における新たな耐性遺伝子発現メカニズムの解明
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19K17922
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
橋本 佑輔 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (40649381)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | バンコマイシン耐性 / 腸球菌 / 二成分制御系 / プラスミド / 薬剤耐性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)は代表的な日和見菌であり、治療薬の少なさから全世界的に問題となっている薬剤耐性菌の一つである。国内では抗菌薬の適正使用、感染対策の徹底によりVREの検出頻度は低いものの、散発的に院内アウトブレイクが報告されている。バンコマイシン耐性の発現は二成分制御系（VanR/VanS）により発現調整が行われており、これら二成分制御系を含むバンコマイシン耐性遺伝子群がプラスミドやトランスポゾンに存在することで腸球菌間の水平伝播が容易に起こる。
本研究は腸球菌のバンコマイシン耐性遺伝子群の新規転写調節因子、バンコマイシン耐性遺伝子群のプロモーターの活性化に関する解析を行うことを目的としている。我々が報告したバンコマイシン低度耐性腸球菌の耐性復帰株の全ゲノムシーケンス解析で同定された遺伝子変異情報をもとに、実験株への遺伝子変異導入実験を実施するもバンコマイシン耐性度の変化が認められなかった。これら低度耐性株の耐性復帰株ではバンコマイシン耐性遺伝子群の転写量が増加していることが明らかにされており、腸球菌の保有する二成分制御系の関与を疑い、Nisin誘導発現ベクターへのResponse regulatorのクローニングを実施した。
並行して国内医療機関より分離されたVREの分子疫学・生物学的解析を行ったところ、国内では初めての報告となるVanM型バンコマイシン耐性遺伝子を保有している腸球菌株(E. faecium)を発見した。この株はVanA型バンコマイシン耐性遺伝子も同時に保有しており、これらの耐性遺伝子群は腸球菌の線状プラスミド上(pELF1)に存在することを明らかとした。pELF1は腸球菌で初の線状プラスミドであり、現在更なる解析を実施している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた、バンコマイシン低度耐性腸球菌の復帰変異株の次世代シーケンス解析結果より得た変異情報をもとに行った解析では、バンコマイシン耐性への寄与が否定的な結果であった。一方、腸球菌(E. faecalis)の保有するresponse regulatorのうち、現在までに15個のresponse regulatorのクローニングが終了した。これらのうち、vanRをクローニングしたpMSP3535(Nisin誘導発現ベクター）が実験株中でNisin用量依存性に過剰発現が起こることをqRT-PCR法、並びにSDS-PAGEにて転写・翻訳レベルで再確認した。
更に、国内臨床分離株からVanA/VanMバンコマイシン耐性遺伝子群を保有する線状プラスミド(pELF1)を発見した。本研究は当初の研究計画とは異なるものの、腸球菌初の線状プラスミドであること、またバンコマイシン耐性のみならず複数の薬剤耐性遺伝子を保有しており、その宿主域も広いことから新規性・臨床的重要性が高い発見と考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.腸球菌の二成分制御系とバンコマイシンを含む薬剤耐性に関する網羅的解析
pMSP3535(Nisin誘導発現ベクター）を用いた全てのresponse regulator過剰発現株を作成する。作成したresponse regulator過剰発現株についてminimum inhibitory concentration等によるバンコマイシンを含む網羅的な薬剤耐性への影響について確認を行う。耐性度の変化がみられたresponse regulatorについては、転写レベルへの関与についてqRT-PCR, バイオインフォマティクス解析、gel-shift assay等による解析を行う。
2.腸球菌の線状プラスミドに関する分子疫学・分子生物学的解析
線状プラスミド(pELF1）は両末端が異なる構造(hairpin end/Invertron end)をした非常に珍しい構造をしていると推測される。Invertron endに結合しているTerminal proteinの分離・同定をPulsed-field gel electrophoresis、超遠心、質量分析にて試みる。また、腸球菌の線状プラスミドについて、国内臨床分離株を中心とした分子疫学的解析を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
当初予定していたプロモーター活性測定法（qRT-PCR等）について、予期せぬ結果の為に実験頻度が少なかった為、研究費に未使用額が生じた。
令和2年度以降は転写活性測定、質量分析などの実験を行う予定であり、前年度の研究費も含め計画的に使用していく予定である。
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