カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌（CPE）におけるホスホマイシン耐性機構の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K17941
• Research Institution: Fujita Health University
• Principal Investigator: 伊藤 亮太 藤田医科大学, 医学部, 講師 (50813359)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 耐性菌 / ホスホマイシン / カルバペネム耐性腸内細菌科細菌

Outline of Annual Research Achievements

藤田医科大学病院で検出されたカルバペネマーゼ腸内細菌科細菌77株を研究対象とした。菌種は微生物の生化学的性状より、菌種内訳はEnterobacter cloacae complex48株、Klebsiella pnuemoniae 29株であった。感受性試験はディスク法で行い、全株カルバペネムは耐性であった。ホスホマイシンの感受性についてはEnterobacter cloacae complex は22株で感性、K. pneumoniaeは11株で感性であった。
またこれらの全77株はIlluminaのMiseqを用いて全ゲノム解析を行った。得られたFastqファイルはnullarborパイプラインによって、アセンブリ、薬剤耐性遺伝子の検索、MLST解析、SNPsによる系統樹解析を行った。Blastで菌種同定も行い、全株生化学的性状と一致した。
Enterobacter cloacae complex株はMLST解析ではST78が32株と最多で、ST133が10株と次いで多かった。また48株全株がblaIMP-1遺伝子を保有しており、46株でホスホマイシン耐性に寄与するfosA遺伝子を保有していた。
Klebsiella pnuemoniae株はMLST解析でST517が20株と最多であった。カルバペネマーゼ耐性遺伝子としては、24株でIMP-1を保有していた。そのほかの5株については現在解析を進めている。fosA遺伝子は全29株で保有が確認された。
Enterobacter cloacae complex株, Klebsiella pnuemoniae株ともに全株fosAを保有していたにもかかわらず、感受性試験で差異が認められた。今後FosAの発現量をRT-PCRで確認し、そのほかのホスホマイシン耐性遺伝子についても解析を進めていく予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Enterobacter cloacae complex感性株の中で、ディスク試験で阻止円内にコロニーを発育する株を複数認めた。そのため、感性株と耐性株の比較の前に、親株（感性株）と娘株（耐性株）について全ゲノム解析でホスホマイシン耐性について解析を進めている。娘株（耐性株）において、uhpTとその周辺領域に欠損を認め、ホスホイシン能動輸送系が耐性に寄与している可能性がある。今後、糖質利用能解析もすすめ、表現型の確認をおこなっていく。

Strategy for Future Research Activity

ディスク試験で認められた親株（感性株）と娘株（耐性株）の比較解析を進める。表現型解析として、糖質利用能解析を行い、能動輸送系の機能を確認する。またGlpT, UhpTにおいてRT-PCRを行い、蛋白発現量も確認する。これらのデータをまとめ、本年度中の論文化を目標とする。
また同時にホスホマイシン耐性株、感性株のゲノムデータを用いて、SNP解析を進める。ホスホマイシン耐性と関わっていると予測される遺伝子について低コピープラスミドを用いたクローニングを行い、耐性化との因果関係を確認する

Causes of Carryover

ディスク試験で親株（感性株）と娘株（耐性株）の比較を優先して研究を行う必要があった。それによりRT-PCR等の追加研究を行う必要がでてきた。そのため、当初予定していたRT-PCRに必要な試薬類の購入を次年度使用に繰り越す必要がある。