Ｎ型糖鎖による抗原性多様化が免疫逃避とインフルエンザ流行に及ぼす影響の実験的検証

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K17943
• Research Institution: Kawasaki Medical School
• Principal Investigator: 後川 潤 川崎医科大学, 医学部, 助教 (00299182)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: インフルエンザウイルス / 香港型 / N型糖鎖 / 糖鎖プロファイル / 抗原性多様化 / 抗原相同性 / ワクチン / リバースジェネティクス

Outline of Annual Research Achievements

インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（HA）は、国内の予防接種に用いられるスプリットワクチンの主要抗原タンパク質である。A/H3N2（香港型）インフルエンザウイルスのHAは主要抗原部位（major antigenic site: MAS）のアスパラギン結合型（N型）糖鎖付加・欠損を伴う遺伝子変異が生じやすく、ワクチン株と市中流行株との抗原相同性不一致の一因であると考えられる。本研究は、香港型ウイルスのHA-MASに潜在する「糖鎖付加および糖鎖欠損による抗原性の多様化」がウイルス感染に対する宿主応答やエピデミックな流行に及ぼす意義を明らかにすることを目的としている。本年度は以下の成績を得た。
① Global initiative on sharing all influenza data (GISAID)に登録されている、直近5シーズンに国内で流行した香港型のHA塩基配列情報を分析し、HA-MASのN型糖鎖プロファイル（アミノ酸ドメイン：#122, #126, #133, #144, #158および#165の糖鎖の付加と欠損による組合せ）を解析した。
② 様々な糖鎖プロファイルのHA遺伝子を、mutagenesis法を用いて作製し、WSN株を骨格としたリバースジェネティクス（RG）法により組換えウイルスを作製した。
③ 組換えウイルスの感染増殖能を赤血球凝集試験およびプラークアッセイで評価し、生体への感受性をC57BL/6マウスへの感染実験により検証した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

過去に流行した香港型ウイルス（A/Tokyo/02-35/2012）の塩基配列情報をもとにHAとノイラミニダーゼ（NA）を人工合成し、これを基点としてHAに塩基置換を導入して糖鎖プロファイルが異なる組換えウイルス（H3N2-WSN）を作製した。組換えウイルスをイヌ腎由来（MDCK）細胞で増殖させる過程において、幾つかのウイルス株は子孫ウイルスの力価が著しく低く、また導入した置換変異の‘戻り’が生じた。これらの問題点を解消するために組換えウイルスの作製方法等を検討した結果、NAをAichi/68株由来のNAに変更することでウイルス力価が向上した。さらに、ヒトインフルエンザウイルスの細胞受容体であるα-2,6結合シアル酸受容体を過剰発現したイヌ腎由来（MDCK-SIAT）細胞を用いることで、変異の戻りが起きないことが確認され、問題点を解消することができた。

Strategy for Future Research Activity

MDCK-SIAT細胞で増殖させた組換えウイルス株から、ワクチン製造方法に準じてHA分画を抽出・精製してHAスプリット抗原を得る。抗原をマウスに免疫して抗ウイルス血清（抗体）を作製し、各組換えウイルス株に対する中和活性および交叉反応性を赤血球凝集抑制試験（HI-test）やplaque reduction法で検証する。その結果に基づいて、交叉中和活性の高い抗体を誘導できたHA抗原の糖鎖プロファイル（数や配列の組合せ）の共通性等を分析する。次に分析結果に基づいて、糖鎖プロファイルが異なる複数のHA抗原を混合したmulti-HA抗原をマウスに免疫して抗体を作製し、各組換えウイルスに対する中和活性を調べる。その後、multi-HA抗原のワクチンとしての効果および有益性を動物感染実験等で総合的に検証していく。