心停止肝細胞移植におけるviability上昇のための新しい機械灌流法の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18019
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 藤尾 淳 東北大学, 高度教養教育・学生支援機構, 助教 (50723954)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 肝細胞分離 / モデル作成 / 至適酵素の調整

Outline of Annual Research Achievements

肝細胞移植は、簡便、低侵襲といった利点がある一方、viabilityが低く、細胞ソースが不足しているなど克服すべき課題は多い。本研究は、年間50例ほど生じる医学的理由によって利用されない心停止肝グラフトに着目した。我々のグループは以前より呼吸停止から死戦期をむかえ、全身の血流低下を経て心停止を誘導する心停止ドナーモデルを確立し、死戦期を経た心停止肝グラフトの温阻血再灌流障害の病態解明を行ってきた。ex vivoの灌流実験で肝保護作用のあるプロスタグランジンE1 (PGE1)の添加を行うことで、in vivoの肝移植実験において心拍出下肝グラフトと同等の移植成績があること、さらに心停止肝グラフトの冷保存後に短時間の酸素化バッファーの常温還流を行うことで肝グラフトのviabilityが向上することなどを発表してきた。その一連の成果を肝細胞移植に応用することで心停止肝グラフトからの肝細胞移植が期待できるのではないかという着想に至った。本研究の目的は、心停止肝グラフトに対して肝保護作用のある薬剤を添加しex vivoの灌流を行い、肝細胞を保護したのちに肝グラフトを分離して、肝細胞のviabilityの上昇を認めるか検討することである。
まず初年度は細胞分離を行う酵素を使用して、Lewisラットの肝細胞分離の習得を行い、並行してPGE1含有灌流プロトコールを確立させ灌流液分析を行い、灌流液中の炎症性サイトカインの評価を行う。その後、心停止モデルを使用して肝グラフトを摘出し、6時間冷保存したのちに室温酸素化灌流および、移植想定の常温灌流を行い、肝細胞を分離してADP/ATPによるviabilityの評価を行うこととした。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

肝細胞分離は肝臓移植と異なり、細胞分離であるので、手技が安定しないと収量が安定しないことがわかった。現在心拍出下ラットより肝細胞分離を行っているが、収量にはばらつきがあり、まだ本研究を始める段階ではないと思われる。そのような状況であるが、一度心停止30分後の肝細胞分離を行ったが、ほとんど収量は回収されず、コントロールとして心停止30分というのは妥当な時間なのか再度検討する必要があると考えている。
また灌流装置が以前使用してから時間が経過しているため、少し不具合が生じており潅流液を回収できないようになっており、現在その修理、改善を行っているところである。

Strategy for Future Research Activity

まずはラットの肝細胞分離の手技の安定を第一に考え、分離の回数、数量を上げていく必要があると思われる。また手技が安定したところで、心停止時間を再度検討し、適切なコントロール時間を置く必要があると思われた。
灌流装置の不具合で、潅流液が径門脈的に注入はできるが、閉鎖回路で回して潅流できない状態であり、保存的のサイトカインがはかれない状態であるので、まずは灌流装置の改善に努めていく。もともと予算では灌流装置の購入は検討していなかったが、現在の灌流装置で研究継続が難しい場合は、新しい装置を購入することを検討する。

Causes of Carryover

灌流装置の不具合によって、新規灌流装置を購入する必要性がでてくる可能性を考慮して、すこし研究を遅らせた部分はある。その他、次年度は手技の安定化を早く進めていくために、実験動物の購入を進め、積極的に研究を遂行していく予定である。
また早期に灌流装置の使用の有無を判断し、購入する場合は早めに購入していく予定である。