lncRNAによるオリゴデンドロサイト分化の制御と再生医療への応用

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18044
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 井上 順治 大阪医科大学, 医学部, 助教 (20814859)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: オリゴデンドロサイト / グリア細胞 / 脱髄 / lnc-RNA / Dry解析

Outline of Annual Research Achievements

オリゴデンドロサイトの分化を制御するロングノンコーディング(lnc)-RNAのプロファイルを作成に用いる各ステージのオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)のRNAサンプルを得るために、既存のプロトコールに従い、多能性幹細胞(iPS細胞)をオリゴデンドロサイトへ分化誘導させたのち、リアルタイム(RT)-PCRおよび免疫組織法を用いて細胞の分化度合いを評価した。RT-PCRでは、分化を終えた細胞集団は血小板由来成長因子 (PDGFR)A受容体をはじめ、複数のOPC特異的マーカーを発現していたことを確認した。しかし同様に分化誘導したサンプルに対し、免疫組織化学法を行った結果、OPC特異的マーカーが陽性の細胞集団と陰性の細胞集団が共に存在していたことが分かった。そのため、分化誘導によって複数種類の細胞集団が存在することが明らかになった。このサンプルに対しRNA発現解析を行っても、正確なRNA発現プロファイルを得られないと考えたため、現在はどのようにして細胞の分化度合いを揃え、より均一な細胞集団を回収するかについて、方法を検討している。
このlnc-RNA採取のためのウェット実験と同時に、得られる予定であるRNAデータをDry解析するためのパソコン機器、および解析指南書を購入し、解析の技法について学んだ。また解析の予行演習として、既存のデータベースThe Sequence Read Archive (SRA)より脱髄疾患患者の次世代シークエンス解析データをダウンロードし、STAR-RSEMおよびkallisto-DEseqのパイプラインを用いて、バイオインフォマティクス的にRNAの発現量解析を行った。その際に得られたいくつかの結果は、現段階でどこにも報告がなされていなかったため、今後取りまとめて論文報告する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ウェット実験ではオリゴデンドロサイトの培養を行い、iPS細胞のオリゴデンドロサイトへの分化を確認した。ただ解析対象をオリゴデンドロサイトに分化した細胞のみに絞りたいので、ドライ解析にまで至っておらず、研究にやや遅れが生じている。問題点を解決するために、現在はオリゴデンドロサイト特異的マーカーを発現した時にGFPを発現する細胞株の確立に従事している。この細胞株が完成すれば、解析対象をオリゴデンドロサイトのみに限定できる。

Strategy for Future Research Activity

推進方策は計画書と同様に分化させたオリゴデンドロサイトのRNAサンプルを採取し、次世代シークエンス解析を行い、発現プロファイルを作成する予定である。
またこのプロファイルを用いて、よりオリゴデンドロサイト分化の効率化を行いたいと考えている。

Causes of Carryover

次世代シークエンス解析を一旦止めているため、この解析に用いる資金分の次年度使用額が生じた。次年度は次世代シークエンス解析を実施するため、解析に必要な費用等に使用する予定である。