肝内胆管癌のエピジェネティクス解析による新規バイオマーカーと治療標的分子の探索

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18121
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 吉田 一博 岡山大学, 大学病院, 助教 (60824761)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 肝内胆管癌 / 免疫微小環境 / CD8 / Foxp3

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は肝内胆管癌のエピジェネティクス解析による新規バイオマーカーの探索と分子標的治療の創造である。肝内胆管癌の発癌・進展に関与する候補遺伝子をバイオインフォマティクスアプローチにより絞り込み、肝内胆管癌の切除検体および細胞株を用いてその臨床的意義と機能について検証を行う。
2019年度では、肝内胆管癌の発癌・進展に関わる7つの候補遺伝子の遺伝子発現プライマーの設計を行い、In silicoでの解析を進めた。FFPEを用いた遺伝子発現解析では、組織から抽出するRNAが比較的細かく断片化されているため、PCR産物の長さが短いものを（50bp～70bp）得られるよう工夫を要した。これらを、胆管がん細胞株、FFPE切片より抽出したRNAを用いて、実際の組織での発現解析におけるプライマーの妥当性、再現性について検証中である。
また、それら7つの候補遺伝子の遺伝子発現制御機構として着目しているDNAメチル化についても検証した。DNMIVD (DNA Methylation Interactive Visualization Database)を用いて、遺伝子発現に関わるDNAメチル化領域を同定した。DNMIVDはTCGAより得られたデータを基に解析が行われている。遺伝子プロモーター領域で有意に発現調節を受けているのは、MELTF（Spearman順位相関係数 -043）、NR5A2（Spearman順位相関係数 -0.34）であり、より適切なプロモーター領域内のCpG siteを選定し、メチル化解析用のプライマー設計を行う。また、他の5つの遺伝子については、Gene bodyやCpG shoreなどプロモーター領域以外での遺伝子発現調節について現在確認中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

再現性のある遺伝子発現解析、DNAメチル化解析を行うためプライマー設計に時間を要し当初予定していた研究の進捗状況と比較しやや遅れているものと思われる。ただし、解析対象となる組織、細胞株からはすでにRNA、DNAの抽出を終了しており、条件設定の後すぐに発現解析、エピジェネティック解析に進むことが可能である。

Strategy for Future Research Activity

7つの候補遺伝子の遺伝子発現および遺伝子promoter領域、Gene bodyのDNAメチル化解析を行う。また、back up planとして、当科で切除された肝内胆管癌の内、早期癌と進行癌の検体を用いて、DNA メチル化アレイおよび遺伝子発現microarrayを行い、遺伝子発現調節機能をもつDNAメチル化の解析を進める。

Causes of Carryover

今年度においては研究の進捗状況および世界情勢から海外学会での発表が困難な上記用であり、海外学会での発表のため計上した旅費などを使用することがなかった。また、論文などの誌上発表もないため、投稿にかかる経費なども使用することがなかった。試薬については廉価で購入することが可能なものが多かったため、当初の想定よりも使用額が少なくなっている。
今年度は、学会参加、論文発表については積極的に行う予定であり、また、研究そのものについても遺伝子発現解析やメチル化解析、細胞株を用いた機能解析のためにより多くの試薬の購入が予定している。