nickase-Cas9を用いた新たなB型肝炎ウイルスDNA排除戦略

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K18123
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 栗原 健 九州大学, 大学病院, 助教 (50823598)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: HBV / nickase-Cas9 / pair nicking

Outline of Annual Research Achievements

B型肝炎ウイルスゲノムを標的するにあたりジェノタイプ間で保存されたHBc蛋白をコードする領域に対して2つのsgRNAをデザインした。細胞内でHBVウイルスを複製しうるHepG2.2.15.7細胞にnickase-Cas9蛋白とsgRNA-HBc-1とsgRNA- HBc-2をレンチウイルスベクターを用いて遺伝子導入した。Surveyor法によってターゲット配列における変異導入を評価したところ、nickase-Cas9蛋白とsgRNA- HBc-1とsgRNA-HBc-2をペアで発現させた細胞では変異導入が見られたが、いずれかのsgRNAとの供発現においてはターゲット配列に変異導入は見られなかった。 nickase-Cas9とB型肝炎ウイルスゲノムの両鎖を標的としたペアのsingle-guide RNAをB型肝炎ウイルスが複製する肝癌細胞株にレンチウイルスペクターを用いて発現させたところ、標的となるB型肝炎ウイルスゲノムに対してDNA2本鎖切断が起こり、細胞株内のウイルス蛋白やウイルスの複製が抑制された。マウス肝臓内においてnickase-Cas9蛋白発現プラスミドと2つのsingle-guide RNA発現プラスミド及び標的となるB型肝炎ウイルスゲノム配列を持つルシフェラーゼ発現プラスミドを、ハイドロダイナミック法を用いてマウスに尾静脈より導入したところ、マウス肝臓内で標的となるB型肝炎ウイルスゲノムの切断が確認された。以上より、nickase-Cas9蛋白とペアとなるsingle-guide RNAの組み合わることによって、宿主DNAへの変異導入のリスクを低減した感染細胞核内のB型肝炎ウイルスゲノムの完全排除の可能性が見出された。