Neoantigenを標的とした個別化iPSDCs癌ワクチン療法の基礎研究

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18131
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 北谷 純也 和歌山県立医科大学, 医学部, 学内助教 (30596979)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: neoantigen / iPS細胞 / 樹状細胞 / 癌免疫療法

Outline of Annual Research Achievements

私達は，担癌患者における成熟能や抗原提示能の低下といった樹状細胞療法の問題を克服するために，患者由来の単核球を初期化し，iPS細胞由来樹状細胞 (iPSDCs) へと分化させることで，優れた成熟能を示し，腫瘍抗原特異的な抗腫瘍効果を発揮することが可能であることをこれまで報告した．しかしながら，樹状細胞療法に用いる腫瘍関連抗原に関して，正常細胞にも発現する共通抗原を標的としている限りは，治療効果が低く，正常細胞への副作用が問題となる．そこで本研究の最も重要な目的は，正常細胞には発現せず，腫瘍における遺伝子変異によってのみ発現するneoantigenを標的としたiPSDCsの作成を行い，副作用が少なく，且つ強力な抗原提示が可能な個別化癌ワクチン療法の基礎的研究を行うことである．まず，初年度の研究では，倫理審査の後，大腸癌担癌患者の末梢血単核球からiPS細胞を樹立し，分化誘導したiPSDCsに腫瘍細胞から抽出したwhole RNAを遺伝子導入することでneoantigenに由来する，無数のneoepitope peptideを提示すると想定されるiPSDCsの作成を3名のドナーから行った．そのwhole RNAを遺伝子導入したiPSDCsの刺激により誘導された担癌患者由来の細胞傷害性T細胞 (CTL)は，CTOS法でライン化した患者自身の癌細胞に対し，癌細胞特異的な細胞傷害性を示すことが，いずれの患者においても証明された．さらには，単一の共通抗原（CEA遺伝子）を導入したiPSDCsとの細胞傷害性の比較では， whole RNAを導入したiPSDCsによって誘導されたCTLは，単一共通抗原を遺伝子導入したiPSDCsによって誘導されたCTLよりも，高い細胞傷害活性を示した．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

実験計画は概ね順調に進んではいるが，mRNAの遺伝子導入に関しては，腫瘍細胞から抽出したmRNAは極微量であり，抽出のみでは，非常に多くのCTOS法でライン化した腫瘍細胞が必要であることが問題であった．そこで，効率的に遺伝子導入に必要なRNAの量を確保するために，in vitroで逆転写することで，十分な量,具体的には元の量の30000倍のRNAを得ることが可能であった．このwhole RNAを導入したiPSDCsによって誘導されたCTLは，単一抗原遺伝子を遺伝子導入したiPSDCsによって誘導されたCTLよりも，高い細胞傷害活性が示された．このことからも，whole mRNAを遺伝子導入することで，多数のneoepitope peptideが抗原提示され，高い細胞傷害性を引き出した可能性の裏付けとなるデータが得られた．現在のところ,大腸癌担癌患者のみでのデータであり,他癌腫（膵臓癌,食道癌,胃癌）などを対象とし, 共通抗原であるWT1やMesothelinを導入したiPSDCsにより誘導されたCTLsと比較して，whole RNAを導入したiPSDCsによって誘導されたCTLは，強力な抗腫瘍効果を示すかどうかCr release assayで比較検討しているところである．また，すでに検討が行われた，大腸癌担癌ドナーの腫瘍細胞の遺伝子変異の網羅的解析を行うために，CTOSから抽出したDNAの変異遺伝子を次世代シーケンサーで確認した．まだ，一名のみであるが2000以上の遺伝子変異が明らかとなった．特に，このドナーにおいては，自身のCTOS細胞に対する，細胞傷害性が高い結果であり，変異数と，抗腫瘍効果に関しては，相関する可能性が示唆された．

Strategy for Future Research Activity

近年の次世代シーケンサーの発達により，ヒトの癌における遺伝子変異の解析が進み，そのデータを集積したCOSMIC(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)やTCGA(The Cancer Genome Atras)などのデータベースが構築されている．whole RNAを遺伝子導入したiPSDCsがneoantigenを抗原提示し，強い細胞傷害活性を持つCTLを誘導しているかの検証には，変異遺伝子解析から，neoantigen peptide の合成の候補となる遺伝子配列を同定する必要がある．候補となるneoantigen peptideが同定されれば，このpeptideに対する，whole RNAを遺伝子導入したiPSDCsワクチンにより誘導されたCTLの免疫応答が， neoantigenを介する癌免疫療法として機能しているかの基礎的根拠となりうるはずである．さらに，実際の担癌モデルにおける，in vivoでの実験系として， whole RNAを遺伝子導入したiPSDCsのNOD/SCID mice皮下腫瘍および腹膜播種モデルにおけるワクチン効果の検討を行う予定としている．現在，免疫チェックポイント阻害剤のみでは2割程度の限られた患者にしか効果を示さない．しかし，積極的にneoantigenを標的にした治療を行うことで，効果のなかった患者にも治療効果の改善が期待される． neoantigenを標的とした治療は，患者個々に発現した固有の抗原が対象になり，本研究での患者由来のiPSDCsとの併用は究極の個別化癌免疫療法として癌ワクチン研究をさらに発展，応用する可能性がある．これらの基礎研究により，whole RNA導入iPSDCsの優れた有用性が証明されれば，臨床応用のための，再生医療法に基づく準備を整えていく所存である．

Causes of Carryover

次年度使用額が生じたのは，iPSDCsを分化誘導する際のrhIL-4を購入予定であったが，膵癌担癌ドナーにおけるWT1やMesothelinを導入したiPSDCsの作成途中であることから，次年度に入ってすぐの購入の方が，品質として妥当と考えられたためである．次年度の予算計画に加え，WT1やMesothelinを導入したiPSDCsにより誘導されたCTLsとwhole RNAを導入したiPSDCsによって誘導されたCTLの比較検討の研究必要経費として使用させていただきたい．