静脈グラフト内膜肥厚における外膜細胞の保護的役割とエクソソームの関与

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18168
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 竜川 貴光 旭川医科大学, 大学病院, 助教 (80837914)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: エクソソーム / 末梢動脈疾患 / 血管内膜中膜肥厚

Outline of Annual Research Achievements

末梢動脈疾患に対する下肢動脈バイパス術は、特に重症度の高い患者に対して現状最も治療成績の良い手術療法である。しかし、術後問題となる合併症にグラフト狭窄があり、開存率及び病態予後に影響しうる大きな課題となっている。原因の一つに内膜中膜平滑筋細胞の異常増殖があるが、本研究では、中膜由来平滑筋細胞の増殖を外膜由来線維芽細胞がエクソソーム介して制御機構の探索を行うものであり、2019年度より開始している。
本研究は基本的にバイパス術施行時、手術材料となった患者の静脈残存片を用いるが、2年目となった2020年度では、コロナ禍の影響で手術件数の減少、実験の制限などあり、想定より検体は採取できなかった。それでも、昨年度のストックも用いると一定数確保でき、実験を継続できた。
本年は引き続き中膜由来平滑筋細胞と外膜由来線維芽細胞を共に培養することでの増殖能への影響の評価に加え、実際に細胞間のコミュニケーションツールとして着目されるエクソソーム抽出を試みた。初期は回収こそすれど微量であり、濃度としては検出可能な域まで達しなかった。回収元の検体を可能な限り増殖させてから回収することで徐々に回収量を確保できるようになったが、検体量を増加させる分細胞の培養期間も長くなり、培養経過中での細胞特性の変化も憂慮されるため、その点での条件設定を検討しつつ、実験を継続している。試行回数はまだ少ないが、エクソソームを培養液に添加することでも平滑筋細胞増殖能が低下する傾向を認めた。今後、よりエビデンスを蓄積するとともに、原因遺伝子の検索への着手を検討する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

実験計画が遅れている理由は2点ある。
一点目は本年はコロナ禍に苛まれ、大学レベルでの実験制限が長期にわたりかかっていた。同様に、本実験は検体を手術施行時の患者由来静脈を用いているが、手術件数も制限がかかっていたため、想定よりも患者からの検体取得機会が失われてしまったため、思うように評価すべき検体自体が得られなかった。
二点目は、想定よりも採取細胞からのエクソソーム抽出に難渋した点である。エクソソームは培養上清からの回収を行っているが、現状採取しうるエクソソーム濃度が微量である。細胞自体の特性なのか、手技的な問題なのか、検討を繰り返し、徐々に改善中である、

Strategy for Future Research Activity

緩慢ではあるが、エクソソームの抽出法は改善傾向であり、現在はエクソソームの中膜平滑筋細胞への取り込みの確認、エクソソーム添加による細胞増殖能への影響を評価中である。
今後は試行回数を増やしより精度を高めるとともに、エクソソーム中に含まれる成分（miRNAなど）を次世代シークエンスにより解析することで、標的遺伝子を特定し検証するなど内容を深めていきたい。

Causes of Carryover

今年度はコロナ禍による検体採取及び実験進行の制限など、実験活動に支障をきたしたため、予定よりも支出が低く経過した。しかし、次年度の中で次世代シークエンスなど費用の掛かる実験を計画している。