2020 Fiscal Year Research-status Report

体外循環時の酸化ストレスによる赤血球溶血の機序解明と新規予防法の開発

Research Project

Project/Area Number	19K18196
Research Institution	Tenri Health Care University
Principal Investigator	曽山奉教天理医療大学, 医療学部, 准教授 (10811797)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	体外循環 / 酸化ストレス / レドックス / チオール基のラベル化 / 赤血球溶血 / 赤血球内抗酸化物質
Outline of Annual Research Achievements	体外循環（人工心肺）を使用した心臓手術では人工肺より高流量の酸素を吹送するため、血液は過度の酸化ストレスに曝される。この酸化ストレスが手術後の予後に影響する赤血球溶血関連合併症を引き起こすことが考えられており、赤血球内の酸化ストレスをモニターする方法の開発が必要である。そこで、レドックス（酸化還元）制御蛋白質である赤血球中のチオレドキシン（thioredoxin; TRX）に注目して、酸化ストレスがTRXのチオール基数に及ぼす影響をチオール基のラベル化（ゲルシフトアッセイ）により検討した。 1) 過酸化水素が赤血球内のTRXのチオール基数に及ぼす影響を確認するため、全血を各濃度の過酸化水素溶液で曝露し、Protein-SHifter Plusによるラベル化を行った。しかし、過酸化水素濃度とは無関係に赤血球TRXは酸化状態であった。ラベル化の前処理で使用する溶血液中の酸素分圧は約180mmHgあり、溶血操作により赤血球内TRXが酸化されていると考えられた。2) PEG-PCMal(SB20：DOJINDO)を用い、赤血球溶血とチオール基のラベル化を同時に行ったところ、採血直後の赤血球内TRXのチオール基数は減少せず、赤血球内のin vivoのTRXを還元状態でとらえることができた。3) 酸素ガスによる全血のbubbling、密閉容器（プレザパックII：TERUMO）による全血の酸素化、および過酸化水素溶液による赤血球の酸化を試みたが、意外なことに、いずれの方法においても赤血球内TRXのチオール基の酸化はみられなかった。4) 過酸化水素溶液による赤血球の酸化により、過酸化水素濃度の上昇に伴い高感度に酸化還元状態が変化する新たな分子（未発表）を検出することができた。これらの結果は、赤血球内のTRXは高濃度の酸化ストレス環境においても還元状態に保護されていることを示唆している。一方、本検討で検出した赤血球内の分子（未発表）は、新たな酸化ストレスのマーカーになりうる可能性がある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 本検討で検出した新たな酸化ストレスマーカー（未発表）を質量分析で同定するまでは概ね順調であった。しかし、2020年度は新型コロナウイルスへの対応で計画通りに研究が進行しない。
Strategy for Future Research Activity	（1）同定した新たな酸化ストレスマーカー（未発表）に関し、過酸化水素や酸素ガスに対する酸化還元能をレドックスラベル法を以って検討する。（2）面光源で赤血球に近赤外光（800nmおよびその近傍、比較対照には白色光）を照射し、新たな酸化ストレスマーカーの還元能およびシステイン残基酸化修飾を解析することで、近赤外光の有無による赤血球内抗酸化物質保護効果を評価する。（3）体外循環中に発生する酸化ストレスが赤血球内抗酸化物質に与える影響を確認するため、本研究への同意を得た体外循環症例の血液を用い、(1)で解析した新たな酸化ストレスマーカーの酸化還元状態をモニタリングする。
Causes of Carryover	2020年度は新型コロナウイルスへの対応で研究が計画通りに進んでいないため。