体外循環時の酸化ストレスによる赤血球溶血の機序解明と新規予防法の開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18196
• Research Institution: Tenri Health Care University
• Principal Investigator: 曽山 奉教 天理医療大学, 医療学部, 准教授 (10811797)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 体外循環 / 酸化ストレス / レドックス / チオール基のラベル化 / 炭酸脱水酵素

Outline of Annual Research Achievements

体外循環（人工心肺）を使用した心臓手術では人工肺より高流量の酸素を吹送するため、血液は過度の酸化ストレスに曝される。この酸化ストレスが手術後の予後に影響する赤血球溶血関連合併症を引き起こすことが考えられており、赤血球内の酸化ストレスをモニターする方法の開発が必要である。そこで、レドックス（酸化還元）制御蛋白質である赤血球中のチオレドキシン（thioredoxin; TRX）に注目して、酸化ストレスがTRXのチオール基数に及ぼす影響をチオール基のラベル化（ゲルシフトアッセイ）により検討した。1) 過酸化水素が赤血球内のTRXのチオール基数に及ぼす影響を確認するため、全血を各濃度の過酸化水素溶液で曝露し、Protein-SHifter Plus(SB12：DOJINDO)によるラベル化を行った。しかし、過酸化水素濃度とは無関係に赤血球TRXは酸化状態であった。2) PEG-PCMal(SB20：DOJINDO)を用い、赤血球溶血とチオール基のラベル化を同時に行ったところ、採血直後の赤血球内TRXのチオール基数は減少せず、赤血球内のin vivoのTRXを還元状態でとらえることができた。3) 酸素ガスによる全血のbubbling、および過酸化水素溶液による赤血球の酸化を試みたが、いずれの方法においても赤血球内TRXのチオール基の酸化はみられなかった。4) 過酸化水素溶液による赤血球の酸化により、過酸化水素濃度の上昇に伴い高感度に酸化還元状態が変化する新たな分子を検出し、同分子が炭酸脱水酵素であることを質量分析で同定した。5) 市販の遺伝子組み換え炭酸脱水酵素は、過酸化水素濃度の上昇に伴い酸化還元状態が変化することを確認したが、その反応性が非常に乏しいものであった。6) 作製した遺伝子組み換え炭酸脱水酵素は、過酸化水素濃度の上昇に伴い酸化還元状態が顕著に変化することを確認した

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本検討で検出した新たな酸化ストレスマーカーが炭酸脱水酵素であることをを質量分析で同定するまでは概ね順調であった。しかし、2020年度から2022年度は新型コロナウイルスへの対応で計画通りに研究が進行していない。

Strategy for Future Research Activity

（1）精製した遺伝子組み換え炭酸脱水酵素に関し、酸素ガス（流量・濃度）に対する酸化還元能をレドックスラベル法を以って検討する。
（2）体外循環中に発生する酸化ストレスが遺伝子組み換え炭酸脱水酵素の酸化還元状態に及ぼす影響を検討する。
（3）炭酸脱水酵素のSH基に対する特異的なモノクローナル抗体を作製し、ELISA法の開発等を通して体外循環中の酸化ストレスモニター法を確立し、臨床応用への検討を進める。

Causes of Carryover

2022年度は新型コロナウイルスへの対応で研究が計画通りに進んでいないため。