Linkage analysis of Cyclophilin D / Surtuin 3 signaling system in sepsis-associated brain dysfunction

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18307
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 石田 裕介 東京医科大学, 医学部, 助教 (40805884)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 敗血症性関連脳障害 / サイトカイン / ミトコンドリア

Outline of Annual Research Achievements

敗血症性脳症の実態をMPT誘発ミトコンドリア機能不全の中心的役割を担うミトコンドリア・Cyclophilin D（CypD）を介した細胞死・アポトーシス実行経路とミトコンドリアのエネルギー代謝やアポトーシス・酸化ストレス制御を担うSirtuin3(SIRT3)を機軸とした情報伝達系を介するミトコンドリア保護機構の解析のために、敗血症性脳症誘発脳内サイトカイン発現、神経細胞死・アポトーシス形成における脳内ミトコンドリア・CypD・MPTとSIRT3情報伝達系の果たす役割解明を検討した。第8-10週令の雄性C57B6 wildマウス(wild群)とCypD遺伝子欠損(Ppif-/-)マウス(CypD KO群)を用いて回盲部結紮＋2回穿刺による（CLP）誘発敗血症性関連脳障害モデル（SABDモデル）を作製した。モデル作製１、6時間後、1日後（各時間とも5匹の動物を）に凍結切片（25μm）作製と大脳のサンプリングを行いmRNAと蛋白の抽出後，RT-PCRとwestern blotでTNFα,IL-1β,IL-6,IL-8,IL-10などのサイトカインの発現を両群で比較した。同時に敗血症関連脳障害モデルを作製し、メタボローム解析も行った。更に、細胞死・Apoptosisの発現変動をCelestinblue-acid fuchsin染色で、NFkB, p53発現をimmunoblotと免疫染色で行い、両情報伝達系の果たす役割を検討した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

モデルの作成が困難であり、結果に有意差がみられにくかった。
炎症性サイトカインについては、測定ができているが、有意差がなく、敗血症にさらされている時間などの変更を行うなどをして今後実験をすることを検討している。
敗血症性脳症誘発時の脳内ミトコンドリアCypDを介した脳内代謝経路のメタボロームによる網羅的解析については、第8-10週令の雄性C57B6 wildマウス(wild群)とCypD遺伝子欠損(Ppif-/-)マウス(CypD KO群)を用いて回盲部結紮＋2回穿刺による誘発敗血症関連脳障害モデル（SABDモデル）を作製し、メタボローム解析を施行した。

Strategy for Future Research Activity

サイトカイン等を引きつづき条件を変更し行うとともに、敗血症性脳症におけるCypD・MPTと SIRT3情報伝達系の連関解析のために、第8-10週令の雄性C57B6 wildマウス(wild群)、CypD KO群を用いてSABDモデルを作製し、モデル作製12時間後、1、2日後（各時間・両群とも5匹のラットを使用）に脳からmRNAの抽出を行い、蛍光標識を施す。その後、DNAchip上に固定されたオリゴヌクレオチドに標的となる新規遺伝子を含むmRNAをハイブリダイズし、蛍光強度から定量的な遺伝子発現データを得ることでミトコンドリア機能不全から神経細胞死に繋がるCypD・MPTに関与する新規遺伝子とミトコンドリア保護に働くSIRT3情報伝達系に関与する新規遺伝子を捕捉する。さらにRT-PCRを用いることで発現の変動を比較・検討し、両情報伝達系の連関を解析する。

Causes of Carryover

メタボロームに費用が通常よりかかり、トランスブロット TURBO 転写パック 他3点を宮川商店より145,673円にて購入するには残高が不足するため、次年度配分額と合わせて購入予定。