敗血症病態におけるセルフリーDNAの制御とマイクロRNAを用いた遺伝子治療の応用

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18340
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 添田 岳宏 関西医科大学, 医学部, 助教 (30739892)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 遺伝子治療 / 敗血症

Outline of Annual Research Achievements

LPS投与、及び糖濃度の異なる培養液による共培養実験系において、分化単球系THP-1細胞、ヒトMacrophageの細胞内小胞体ストレス、アポトーシス発現、及びその上流の細胞内情報伝達系変化と好中球やNETsを貪食する機能（Efferocytosis）の変化、及び培養液中のcfDNA量を解析した。具体的には以下の項目で、変化が得られた。統計的な有意差があるのか、今後検討していく。a.貪食能（Efferocytosis）蛍光Cell Trackerで標識後、PMA負荷した好中球及びNETsのマクロファージによる貪食能定量。（FCM法）b.培養液中のcfDNA量測定　cfDNA濃縮用に設計され、血清や血漿などの生体サンプルに最適化されているキットを用いて、リアルタイム PCR、次世代シーケンシングを含む広範な用途に適した高品質 DNA を高く回収し、DNAを定量評価。c.　mitochondorial DNA、nuclearDNAを定量　リアルタイムPCR法 d. NETsの半定量　ヒストンHI、好中球エラスターゼ、DAPIの３重染色 e. 細胞内小胞体ストレス変化　細胞内CHOP、BiP発現変化（Western Blotting法、フローサイトメトリー(FCM)法) f. 細胞内Akt, p38MAPKリン酸化/Total(比)変化の定量（WesternBlot法、FCM法）。g. 細胞内ミトコンドリア膜電位変化の定量（JC-1、FCM法）h. 細胞内Bcl-2ファミリータンパク質発現の変化　Bcl-xl、Bcl-2/Bax、Bak比の解析（Western Blotting法、FCM法）i.細胞内カスパーゼ発現の変化Caspase 3, 9（FCM、WesternBlot法、免疫染色法）

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

コロナ禍で、勤務時間に制限がかかったり、実験消耗品の納入が遅れることもあった。また、一部の実験内容を、外部委託しているが外部委託会社の勤務時間が勤務時間短縮等のために、培養細胞を用いた研究が部分的に遅れている。また、敗血症患者を対象とした臨床研究も遅れている。

Strategy for Future Research Activity

2021度は、In Vitroで得られたデータを基に、臨床研究を施行する予定である。

Causes of Carryover

研究実績の概要で記入した培養細胞を用いた研究が、コロナ禍の影響で一部遅延したため、2021年度に繰り越した研究資金を用いて、培養細胞実験に必要な消耗品を購入する。

また、以上のIn Vitroで得た実験結果が、同様のことが得られるか否か敗血症患者を対象とした臨床研究のプロトコールで確認する予定にしているため次世代シーケンサーの実験に必要な消耗品を購入するために、研究資金が必要となる。