2019 Fiscal Year Research-status Report
iPS由来神経幹細胞/嗅粘膜ハイブリッド型グラフトを用いた脳出血治療法の開発
Project/Area Number |
19K18387
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
高垣 匡寿 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (70724433)
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Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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Keywords | iPS細胞 / 脳出血 / 嗅粘膜 / 再生医療 / 移植 |
Outline of Annual Research Achievements |
理化学研究所バイオリソースセンターよりiPS細胞標準株である201B7ラインを先行して導入した。提供元と同一の培養条件である、オンフィーダー条件で安定的に未分化状態を維持できるよう手技を取得した。201B7を未分化状態で維持し、増殖・凍結保存を行った。また解析のコントロールに使用する未分化iPS細胞のRNAなどの取得を行った。つぎに当初計画していたDual SMAD法による神経分化誘導を行なった。V底の96ウエルプレートに未分化iPS細胞を播種、胚葉体形成を行い、培地内にSB431542, LDN193189の2剤を添加するDUAL SMAD法により神経分化誘導を行なった。12日目に胚葉体を解離し、FGF2, EGF, LIFを添加した無血清培地下で培養することによりNeurosphereを効率的に得ることに成功した。これらNeurosphereを分化誘導すると、ニューロンへの分化を確認することができ、ヒトiPS細胞由来神経前駆細胞に誘導できたことが確認された。1継代した段階で十分量の細胞の凍結保存を行った。領域特性などについては、各種マーカーの発現解析を現在進めているところである。また本課題では脳出血モデルへの応用を計画しているが、臨床における脳出血は、大脳を含む病変が頻度的にも多く、後遺障害を来し、臨床上も問題となりやすいため、本課題でも大脳基底核もしくは大脳皮質下の出血モデルへの移植を目指している。神経前駆細胞は大脳系譜へよりコミットしたものを用いる方が効果的と考えられるためヒトiPS細胞由来大脳オルガノイドから大脳系譜の神経前駆細胞を得る方法の開発も追加で進めた。試行的に大脳オルガノイド を201B7株から作成することには成功し、現在詳細なマーカーや分化特性の解析を進めている。解析結果から、いずれかの方法により誘導した神経前駆細胞を次年度の実験に使用するか決定される見通しである。 また、国際学会に出席し、本分野の国際的研究情勢について情報収集を行った。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
iPS細胞を理化学研究所より新規に導入し、神経前駆細胞の分化誘導を2種類の方法で行うことができている。明らかな神経分化を確認することができているが、遺伝子の発現解析などの特性解析(領域特性など)については充分に検討することができず当初計画よりは少し遅れを認める。そのため、今後実験に使用してくiPS細胞由来神経前駆細胞の分化誘導法が十分固まっていない状況である。しかしながら、試料の収集は順調に進められており、当初の計画に十分追いつくことができる範囲内での遅れと考えている。また複数のラインでの検討を行う計画であったが、iPS細胞の安定培養の手技取得・準備にやや時間を要したため、1ラインの導入に止まっている。これについても培養系が安定してきており、新たに2ライン導入し、神経前駆細胞を誘導することは比較的短期間で可能と判断している。
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Strategy for Future Research Activity |
次年度には、今後の実験に使用するiPS細胞由来神経前駆細胞の分化誘導法を決定し、できれば新たに標準株2ライン(409B2, 648A1の非ウイルスベクターによるiPS細胞標準株で理化学研究所より入手可能)を追加導入してiPS細胞由来神経前駆細胞を得る予定である。これらにリポフェクション法を使用してEGFP遺伝子を導入し、その導入効率や今後の細胞のトレーシングに使用できるかも併せて検討を行う予定である。 誘導されたiPS細胞由来神経前駆細胞は、嗅粘膜鞘細胞などのグリア系細胞との共培養系での挙動を解析し、分化効率や細胞生存率、細胞成熟度の評価を進める予定である。主に定量的PCR法や免疫細胞化学による評価を考えている。ラット嗅粘膜鞘細胞を使用する予定であったが、連携研究者の移動などの影響があり、直ちに確保することが困難になる見込みである。特に、線維芽細胞などの混入による純度の確保はおそらく課題となると考えられるが、実験計画に大きな遅れが生じる可能性があるため、当面は実験の容易さなどからシュワン細胞の不死化細胞株などの類似細胞株を使用して検討することを考えている。 また脳出血モデルについては、臨床的に汎用性のある皮質下出血モデルを作出して、移植実験を行なっていきたいと考えており、モデルラットの作出や機能評価系の構築を進めたいと考えている。
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Causes of Carryover |
情報収集の為の学会参加で使用する予定であったが、社会的な問題で学会が中止・延期となったため使用することなく繰り越すこととなった。
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