グリオーマの増殖を抑制する転写因子の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18446
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 山村 奈津美 関西医科大学, 医学部, 任期付助教(専修医) (90809914)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: グリオーマ / AMPA受容体

Outline of Annual Research Achievements

グリオーマは脳の正常組織に浸潤するため、外科的に全摘出ができず再発する。最近、がんの再発や転移の原因としてがん幹細胞の存在が注目されている。私たちは、抗てんかん薬のペランパネルに感受性があるがん幹細胞株を見いだした。さらにこれらの細胞ではGRIA2がダウンレギュレーションしていることに気がついた。本研究では、これらの成果を発展させ、GRIA2サブユニットがAMPA受容体のCaイオン透過性に関わることに着目し、グリオーマ幹細胞の増殖調節に関わる分子メカニズムを解明する。そのためにGRIA2について、転写因子、グリオーマの病態を検証した。
ペランパネルを加えた培地でグリオーマ幹細胞を培養すると、4日間で約50%が死滅した。ペランパネル抵抗性細胞および親細胞（3株）からmRNAを抽出し、RNAシーケンス解析（イルミナ社 NovaSeq 6000）を用いて遺伝子発現差異解析をした。グリオーマ幹細胞において、GRIA2の発現は認めなかった。一方で、GRIA3が高い発現量を示した。またGRIAファミリーの変異解析により、GRIA3のアミノ酸配列に点変異を発見した。このアミノ酸残基はGRIAファミリーで保存されているため、Caイオン透過性に関与する可能性が示唆された。さらにペランパネル抵抗性細胞における上流解析により、転写因子であるMEF2AおよびGATA4を見出した。GRIA3がグリオーマ治療の分子標的に成り得る可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

これまでに、グリオーマ由来のがん幹細胞において、GRIA3が発現していることは知られていなかった。我々はRNAシーケンス解析を用いて、GRIA3のアミノ酸配列において点変異を発見した。さらに転写因子であるMEF2AおよびGATA4を見出した。

Strategy for Future Research Activity

RT-PCR法でGRIA3をクローニングする。シークエンシングし、一次配列を決定する。決定した分子を発現ベクターに挿入する。野生型および変異体GRIA3分子をグリオーマ幹細胞にトランスフェクションし、過剰に発現させる。AMPA3（GRIA3）受容体を介するCaイオン透過性をCaイメージングまたはパッチクランプ法で評価する。転写因子であるMEF2AおよびGATA4をグリオーマ幹細胞にトランスフェクションし、過剰に発現させる。GRIA3の発現上昇をqPCR法で確認する。野生型または変異体GRIA3分子発現グリオーマ幹細胞を免疫不全マウスの脳内に移植する。生存期間と腫瘍のサイズを評価し、変異体GRIA3の発現と予後の関連を調べる。免疫組織化学法を用いて、AMPA3受容体の発現をタンパク質レベルで評価する。

Causes of Carryover

RNAシーケンス解析を用いて、高精度かつ効率の良い遺伝子発現差異解析および変異解析が遂行できた。そのため、予定していた実験を省略することができ、次年度使用額が生じた。消耗品費（培養関連と動物実験）に充当する。

Research Products

• [Journal Article] 破裂脳動脈瘤に対するコイル塞栓術後の血腫増大例の検討 (2019)
  • Author(s): 岩田 亮一, 須山 武裕, 吉村 晋一, 山村 奈津美, 磯崎 春菜, 李 一, 宮田 真友子, 内藤 信晶, 亀井 孝昌, 小森 裕美子, 島田 志行, 羽柴 哲夫, 埜中 正博, 淺井 昭雄
  • Journal Title: CI研究 Volume: 41 Pages: 87～93
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 破裂脳底動脈血豆状動脈瘤に対するステントアシスト下コイル塞栓術の1例 (2019)
  • Author(s): 山村奈津美, 岩田亮一, 須山武裕, 川野晴香, 上野勝也, 内藤信晶, 李強, 小森裕美子, 磯崎春菜, 亀井孝昌, 羽柴哲夫, 吉村晋一, 埜中正博, 淺井昭雄
  • Organizer: 第35回日本脳神経血管内治療学会学術総会
• [Presentation] 破裂脳底動脈血豆状動脈瘤に対するステントアシスト下コイル塞栓術の1例 (2019)
  • Author(s): 山村奈津美, 岩田亮一, 須山武裕, 川野晴香, 上野勝也, 内藤信晶, 李強, 小森裕美子, 磯崎春菜, 亀井孝昌, 羽柴哲夫, 吉村晋一, 埜中正博, 淺井昭雄
  • Organizer: 第77回日本脳神経外科学会近畿支部学術集会