2020 Fiscal Year Research-status Report
変形性関節症の新しい治療 －OAモデルのCD44断片化とADAM10に注目して－
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19K18496
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
鈴木 望人 名古屋大学, 医学部附属病院, 医員 (30826748)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 変形性関節症 / 軟骨変性モデル / DMM手術 / ADMA10 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
変形性関節症の原因解明のため、以前に我々はin vitroにて軟骨変性とADAM10の関連について報告してきた。今回実験計画書をもとに軟骨変性とADAM10の関連について、in vivoモデルを用いて研究を進めている。本研究計画において、軟骨変性モデル(in vivoモデル) として膝関節内側板半月板切除するDMM(Destabilization of the medical meniscus)手技を用いてモデルマウスを作製している。軟骨特異的ノックアウトマウス(CKOマウス)としてCol2a1-cre;ADAM10fl/fl、正常マウス(Wildマウス)としてADAMfl/flに対して、生後8週時点でDMM手術を実施した。術後6週および10週時点でSacrificeしたマウスの膝関節の切片に対してサフラニンO染色を行い、OARSIスコア(Furman BD, et al. J Orthop Res.2007)を用いて軟骨変性を評価した。昨年度の報告にて、CKOマウス/Wildマウスの術後6週モデルではOARSIスコア2.4/1.9、術後10週モデルでは6.1/14.2であった。CKOマウスはWildマウスと比較して、術後6週モデルでは有意差はないものの、術後10週モデルで有意に軟骨変性を抑制していたことがわかった(P<0.05)。今回長期自然経過モデル(in vivoモデル)について大腿骨頭を用いて評価を行ったところ、wild typeマウスに比してADAM10コンディショナルノックマウスでは大腿骨頭表面のサフラニO染色が保たれていた。つまりADAM10をノックアウトすることで自然経過でも起こりえる軟骨変性を抑制することができていたことがわかった。今後in vivo/ex vivoにてDMMモデルおよび自然経過モデルを用いて、膝関節・大腿骨の両方をサフラニン染色/免疫染色/骨形態測定で評価していくことを考えている。軟骨特異的ノックアウトマウスを用いてADMA10発現を抑制することで軟骨変性を抑える可能性が考えられ、そのメカニズムについて究明していくことを考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実施計画では①DMM model(in vivoモデル)②長期自然経過(in vivoモデル)③Explant culture(ex vivoモデル)の３つの軟骨変性モデルを樹立している。
昨年度はDMM modelを作製するためのDMM手術手技習得にある程度時間を要していた。現在はある程度ラーニングカーブがなくなり、順調に手術を行うことで軟骨変性モデルを作製できている。In vivo/ex vivoモデルにおいて、サフラニンO染色での評価を示すOARSIスコアでは有意差を認めているため、今後免疫染色を用いて軟骨分解酵素(MMP3,ADAM-TS4/5など)の評価を行っていく必要があり、免疫染色について計画を立てている。また長期自然経過モデル(in vivoモデル)について、大腿骨頭を用いて評価を行ったところ、wild typeマウスに比してADAM10コンディショナルノックマウスでは大腿骨頭表面のサフラニO染色が保たれていた。ADAM10が軟骨変性に関与していることを示す足掛かりにもなっていることを確認した。今後免疫染色を行い、軟骨分解酵素の評価を行っていくことも必要である。3つのモデルを同時に行うことが困難であることから長期的な時間を要しているが、現時点では予定通り研究が進展しており、引き続き研究を進めていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
軟骨変性の評価ための実験計画として３つの軟骨変性モデルの作製を計画している。今まで行ってきた実験として、DMM手術による軟骨変性モデル(in vivoモデル)およびIL-1α刺激によるexplant culture (ex vivoモデル)、長期自然経過(in vivoモデル)である。現在では膝関節だけではなく、大腿骨頭の両方を用いて組織学的評価を行っており、今後はその切片を用いて軟骨変性に関与するバイオマーカーについて免疫組織染色やCT scanを用いた骨形態評価を行っていく予定である。軟骨および軟骨以外(肝臓・筋肉など)の正常組織にADAM10がどの程度発現しているかについて、遺伝子発現レベル/蛋白レベルで評価していく必要があるため、今後実験計画を立てて遂行していく。以上の結果を評価した後、すでに我々がin vitroで証明している軟骨変性によるCD44断片化亢進、およびADAM10発現を抑制することによるCD44断片化の抑制についてin vivoでも解明していく必要がある。計画している方法として、explant cultureによるex vivoモデルを用いて、大腿骨頭にIL-1α刺激を加えた後、メディウム中のCD44 fragment発現を蛋白レベルで確認することで、CD44断片化の有無について評価を行っていく。ADAM10発現を抑制することによる軟骨変性に関与しているCD44断片化抑制および変形性関節症モデルの軟骨変性抑制を明らかにすることで、変形性関節症の病態解明につがなり、今後の変形性関節症治療および予防につなげていくことができると考えている。
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| Causes of Carryover |
本年度は長期自然経過モデルを作製することを中心に実験を行っていた。自然経過をみていく実験では系統維持および交配などを行っていることが多く、薬剤を使用する機会が少なかった。次年度は今回作製した長期モデルの免疫染色や、短期モデル/ex vivoモデルの免疫染色や骨形態測定を行っていく予定であり、抗体や免疫染色など多くの薬剤が必要となることが予想される。またADAM10発現が軟骨変性に関わるメカニズムについてもさらに究明していく必要がある。
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