2020 Fiscal Year Research-status Report
1細胞RNA-sequenceを用いた停留精巣精子幹細胞ニッチの遺伝子発現解析
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19K18592
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
守時 良演 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (50595395)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 精子感細胞 / 停留精巣 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
[研究I] 停留精巣モデルマウスの作成：2年前に開発した非開腹手術による停留精巣モデルマウスは、昨年度に入り精巣の上昇率がさらに安定した。現在このモデルマウスを用いた構造的な解析を進めている。問題点としては、精巣の上昇位置によって精細管構造の形態変化にばらつきがあり、さらに手技の向上が必要な点である。ただし精巣の位置さえ客観的に評価できれば概ね精細管の形態変化は同一であり、今後の解析には問題ないかと考えている。本マウスの解析も参考に、共著者Taiki Katoらにより停留精巣における血液精巣関門の構造学的解析がなされた(Andrology. 2020 Sep;8(5):1398-1408)。本報告はラットにおける報告であるが、今後本モデルマウスを利用して、同じ解析を行う予定である。
[研究II]1.TypeB精原細胞、2.マウスES細胞でのRNA-sequence：一昨年度取り組んでいた1細胞ＲＮＡ-sequenceのcDNAの増幅のばらつきに関しては、既報を参考に種々の方法を試し、下記の方法で培養細胞にて40コピー/細胞以上のmRNAを安定的に増幅できるようになった。具体的には、1)サンプルの冷却を厳密に行うこと、2)チップや手袋の扱いを厳密に行うこと、3)集中的に増幅を繰り返すことで安定的に手技がこなせるようにすること、の 3点である。現在剪断したcDNAのqualityチェックが概ね問題ないことが確認できたため、現在外部委託によるマウスES細胞でのRNA-sequenceを検討している段階である。
[研究III］マウス精巣でのRNA-sequence：マウス精巣の単離を文献に基づいて行ったが、生化学的なdissociationの条件により、細胞のＲＮＡconditionが大きく異なることが判明。現在条件の最適化を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
[研究II]1.TypeB精原細胞、2.マウスES細胞でのRNA-sequence
1細胞RNA-sequenceの手技の厳密化や、手技が多段階であるたゆえのトラブルシューティングの難しさが遅れの原因と考えられる。
[研究III］マウス精巣でのRNA-sequence
条件によりRNAの状態が大きく異なることや、positive controlの設定が難しいことが遅れの原因としてあげられる。複数回の条件検討により、ブレが少ない手技を徹底して探す必要性に迫られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
[研究II]1.TypeB精原細胞、2.マウスES細胞でのRNA-sequence
上述のごとく今後、ES細胞でのRNA-sequenceを施行し、既報との比較により手技の再現性や確実性を評価する予定である。
[研究III］マウス精巣でのRNA-sequence
これまでの既報、Stevant Iら(Cell Reports 2018)とLukassen Sら(Science Data 2018)のmethodをまずは試す予定である。物理的なdissociationと生化学的なdissocationの条件検討により最適解がみつかれば、今後1細胞のRNA-sequenceへと進む予定である。
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| Causes of Carryover |
停留精巣の幹細胞ニッチで発現が変化している遺伝子(群)を1細胞レベルで同定し、停留精巣における男性不妊症の原因を究明する研究である。初年度は開腹をせずに手術することで停留精巣を得る新しい方法で停留精巣モデル作成をする計画であった。
計画自体は順調な滑り出しであったがCOVID-19による通常の医療業務が大幅に変更となり、予定していた研究を進めることができなかった。このため次年度使用が生じた。次年度のマウス精巣でのRNA-sequenceに有効に使用したい。
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[Journal Article] Disorganization of claudin-11 and Dysfunction of the Blood-Testis Barrier During Puberty in a Cryptorchid Rat Model2020
Author(s)
Kato Taiki, Mizuno Kentaro, Nishio Hidenori, Moritoki Yoshinobu, Kamisawa Hideyuki, Kurokawa Satoshi, Nakane Akihiro, Maruyama Tetsuji, Ando Ryosuke, Hayashi Yutaro, Yasui Takahiro
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Journal Title
Andrology
Volume: 8
Pages: 1398-1408
DOI
Peer Reviewed
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