2021 Fiscal Year Research-status Report
1細胞RNA-sequenceを用いた停留精巣精子幹細胞ニッチの遺伝子発現解析
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19K18592
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
守時 良演 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (50595395)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 停留精巣 / 1細胞RNAシークエンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
[研究I] 停留精巣モデルマウスの作成：3年前に開発した非開腹手術による停留精巣モデルマウスは、今年度精巣の上昇率がさらに安定した。現在このモデルマウスを用いた構造的な解析を進めている。昨年度は精巣の上昇位置によって精細管構造の形態変化にばらつきがあったが、今年度は比較的均一な精細管の委縮をアダルトマウスでは得られるようになってきた。本マウスの解析も参考に、共著者Taiki Katoらにより停留精巣における血液精巣関門の構造学的解析がなされた(Andrology. 2020 Sep;8(5):1398-1408)。マウスとラットでは概ね大きな精細管の違いは現時点では見られていないが、本モデルは精細管委縮が認められるまでに2カ月ほど期間を要することが、抗アンドロゲン剤投薬による停留精巣モデルラットとの大きな違いである。
[研究II]1.TypeB精原細胞、2.マウスES細胞でのRNA-sequence：1細胞ＲＮＡ-sequenceのcDNAの増幅のばらつきに関しては、既報を参考に種々の方法を試し、下記の方法で培養細胞を用いて40コピー/細胞以上のmRNAを安定的に増幅できるようになった。具体的には、1)サンプルの冷却を厳密に行うこと、2)チップや手袋の扱いを厳密に行うこと、3)集中的に増幅を繰り返すことで安定的に手技がこなせるようにすること、の 3点である。剪断したcDNAのqualityチェックが問題ないことが確認できたため、外部委託によるマウスES細胞でのRNA-sequenceを検討している段階である。
[研究III］マウス精巣でのRNA-sequence：マウス精細管の抽出・細胞の単離を文献に基づいて行ったが、生化学的な条件により、細胞のＲＮＡの質が大きく異なることが判明。本年度もconditionの条件検討に取り組んでいたが、現時点では難航している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
[研究II]1.TypeB精原細胞、2.マウスES細胞でのRNA-sequence
1細胞RNA-sequenceの手技の厳密化や、手技が多段階であるたゆえのトラブルシューティングの難しさが遅れの原因である。
[研究III］マウス精巣でのRNA-sequence
細胞単離の条件によりRNAの状態が大きく異なることや、positive controlの設定が難しいことが遅れの原因としてあげられる。複数回の条件検討により、ブレが少ない手技・単離の条件を探す必要性に迫られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
[研究II]1.TypeB精原細胞、2.マウスES細胞でのRNA-sequence
上述のごとく今後、ES細胞でのRNA-sequenceを施行し、既報との比較により手技の再現性や確実性を評価する予定である。
[研究III］マウス精巣でのRNA-sequence
これまでの既報Shami ANら(Dev. Cell. 2020)の精巣単離の方法を試す予定である。物理的なdissociationと生化学的なdissocationの条件検討により最適解がみつかれば、今後1細胞のRNA-sequenceへと進む予定である。positive controlの設定は現在研究室内で議論中である。
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| Causes of Carryover |
停留精巣の幹細胞ニッチで発現が変化している遺伝子(群)を1細胞レベルで同定し、停留精巣における男性不妊症の原因を究明する研究である。計画自体は順調な滑り出しであったがCOVID-19による通常の医療業務が大幅に変更となり、予定してていた研究を進めることができなかった。また国際・国内学会出張も計画していたが、出張することもできなかった。このため次年度使用が生じた。次に最終年度として、マウス精巣でのRNA-sequenceを実施したい。
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