Liquid biopsy法による新規副腎マーカーの開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18603
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 藤田 尚紀 弘前大学, 医学研究科, 講師 (00792318)
• Project Period (FY): 2021-03-01 – 2024-03-31
• Keywords: 原発性アルドステロン症 / cfDNA / バイオマーカー / ヒアルロン酸

Outline of Annual Research Achievements

原発性アルドステロン症（PA）は2次性高血圧の中で最も頻度の高い疾患である。副腎摘除術で治癒が期待できるが、術後も遷延する高血圧症が約半数に見られ、その予測因子は明らかになっていない。我々はこれまで、各泌尿器科疾患における糖鎖解析により、新規バイオマーカーの開発を世界に先駆け発表してきた。この基盤を活用し、PA患者におけるCell free DNA（cfDNA）を抽出し、PAに伴って変化する糖鎖や遺伝子変化（CYP11B2 gene polymorphism等）、血管石灰化に関与する因子（osteopontin, osteocalcin, Runx2, Msx2等）の検出を行うことで、病状や治療抵抗性の分子機構を解明し、新規バイオマーカーを開発することを目的とする。2021年から副腎腫瘍患者の血液採取を開始し、順次解析を行っている。現在45名程度のsampleが集まり、血漿を分離、cfDNAを抽出する作業を行っている。抽出されたcfDNA総量は測定可能であることが確認された。PAに伴って変化する糖鎖や遺伝子変化（CYP11B2 gene polymorphism等）、血管石灰化に関与する因子（osteopontin, osteocalcin, Runx2, Msx2等）のコピー数の測定を進めている。また、我々はグリコサミノグリカンの一つであるヒアルロン酸の代謝に関して研究を行い、Transmenmbrane protein 2 (TMEM2)が細胞外ヒアルロン酸の代謝を担っていることを世界に先駆けて報告した。PAではヒアルロン酸合成酵素であるHAS2やヒアルロン酸分解酵素であるTMEM2の発現が共に低下しており、ヒアルロン酸代謝異常が発症に関与している可能性がある。この可能性を追求するため、手術摘出標本のFFPE切片を作製し検討を開始している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

現在、45例程度のsampleが集まり、順調に解析が進んでいる。しかし、コロナ禍における世界的な試薬不足などにより、実験のペースはやや遅れている。その中でも、抽出されたcfDNAにおける総量は測定可能であることが確認された。さらに、PAに伴って変化する遺伝子変化（CYP11B2 gene polymorphism等）、血管石灰化に関与する因子（osteopontin, osteocalcin, Runx2, Msx2等）のコピー数の測定を進めている。また、手術摘出標本のFFPE切片の作製を進めている。

Strategy for Future Research Activity

抽出されたcfDNAにおける遺伝子変化（CYP11B2 gene polymorphism等）、血管石灰化に関与する因子（osteopontin, osteocalcin, Runx2, Msx2等）のコピー数をddPCRにて測定する。また、網羅的糖鎖解析装置によるPA患者の血清糖鎖プロファイリングを行い、PAに関与する糖鎖、術後高血圧症が改善しない群に特徴的な糖鎖変化を同定する。同定された糖鎖構造を認識するレクチンを用いて、手術標本によるアルドステロン産生腫瘍内の糖鎖構造発現を検討し、レクチンアレイ、レクチンによる免疫染色を用い、糖鎖構造変化の由来を検討する予定である。また、手術摘出標本のFFPE切片を作製し、hyaluronan-binding proteinによるヒアルロン酸の染色、抗HAS2抗体および抗TMEM2抗体による染色を行う。また、我々は全身の細胞でTMEM2がノックアウトされるコンディショナルノックアウトマウスを保有しているため、副腎を採取しフェノタイプを確認する予定である。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由：コロナ禍における世界的な試薬不足のため。
使用計画：試薬およびピペットチップなどの購入費として使用予定である。

Research Products

• [Journal Article] Significance of pelvic lymph node dissection during radical prostatectomy in high-risk prostate cancer patients receiving neoadjuvant chemohormonal therapy (2022)
  • Author(s): Hiromichi Iwamura, Shingo Hatakeyama, Takuma Narita, Yusuke Ozaki, Sakae Konishi, Hirotaka Horiguchi, Hirotake Kodama, Yuta Kojima, Naoki Fujita, Teppei Okamoto, Yuki Tobisawa, Tohru Yoneyama, Hayato Yamamoto, Takahiro Yoneyama, Yasuhiro Hashimoto, Chikara Ohyama
  • Journal Title: Scientific reports Volume: 12 Pages: 9675
  • DOI: 10.1038/s41598-022-13651-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Association of oxidative stress with erectile dysfunction in community-dwelling men and men on dialysis (2022)
  • Author(s): Naoki Fujita, Masaki Momota, Mizuri Ishida, Takuro Iwane, Shingo Hatakeyama, Takahiro Yoneyama, Yasuhiro Hashimoto, Kazuaki Yoshikawa, Kanemitsu Yamaya, Chikara Ohyama
  • Journal Title: The Aging Male Volume: 25 Pages: 193-201
  • DOI: 10.1080/13685538.2022.2103113
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Risk score-based substratification improves surveillance costs after transurethral resection of bladder tumor in patients with primary high-risk non-muscle-invasive bladder cancer (2022)
  • Author(s): Naoki Fujita, Shingo Hatakeyama, Masaki Momota, Yuki Tobisawa, Tohru Yoneyama, Hayato Yamamoto, Hiroyuki Ito, Takahiro Yoneyama, Yasuhiro Hashimoto, Kazuaki Yoshikawa, Chikara Ohyama
  • Journal Title: Scientific reports Volume: 12 Pages: 13786
  • DOI: 10.1038/s41598-022-17973-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Utility of the Age Discrepancy between Frailty-Based Biological Age and Expected Life Age in Patients with Urological Cancers (2022)
  • Author(s): Kyo Togashi, Shingo Hatakeyama, Osamu Soma, Kazutaka Okita, Naoki Fujita, Toshikazu Tanaka, Daisuke Noro, Hirotaka Horiguchi, Nozomi Uemura, Takuro Iwane, Teppei Okamoto, Hayato Yamamoto, Takahiro Yoneyama, Yasuhiro Hashimoto, Chikara Ohyama
  • Journal Title: Cancers (Basel) Volume: 14 Pages: 6229
  • DOI: 10.3390/cancers14246229
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Relationships of low-grade systemic inflammation and nutritional status with erectile dysfunction severity in men on dialysis (2022)
  • Author(s): Naoki Fujita, Shingo Hatakeyama, Masaki Momota, Tomoko Hamaya, Yuki Tobisawa, Tohru Yoneyama, Teppei Okamoto, Hayato Yamamoto, Takahiro Yoneyama, Yasuhiro Hashimoto, Kazuaki Yoshikawa, Chikara Ohyama
  • Journal Title: Andrology Volume: 10 Pages: 1548-1555
  • DOI: 10.1111/andr.13259
  • Peer Reviewed