アルコールとニコチンの同時曝露による精巣内微細環境の変化と精子形成障害の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18623
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 倉升 三幸 (北岡三幸) 東京医科大学, 医学部, 助手 (70468643)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 精巣 / アルコール / ニコチン

Outline of Annual Research Achievements

精子形成障害が増加している背景には、様々な環境化学物質や薬物の曝露が男性生殖器系に悪影響を与え、男性不妊の潜在的な原因として関与していることが広く考えられている。飲酒（アルコール）と喫煙（ニコチン）は我々の生活環境に広く根付いている物質であり、生殖毒性との関連性が検討されてきたが、同時曝露による精巣内微細環境の変化や精子形成障害の機序についての詳細な報告はいまだない。2020年度においては、前年度同様の4週齢のDBA/2系マウスを用い、①正常群、②アルコール群、③ニコチン群、④アルコール+ニコチン（同時曝露）群の４群を作成し、セルトリ細胞障害および自己抗体産生について組織学的解析・分子学的解析を用いて検討した。
結果として正常群、アルコール群およびニコチン群において自己抗体の産生は認められなかったが、同時曝露群において精子細胞・精子に対する自己抗体が認められた。また、セルトリ細胞機能因子（Aqp8、IL-1a、Transferrin、Testinなど）のmRNA発現を調べたところ、アルコール群およびニコチン群では発現変化が認められなかったが、同時曝露群では有意に発現が変化していた。血液－精巣関門関連タンパク質(Claudin11、ZO-1、ZO-2、Occludin)も発現が低下していたことから同時曝露群ではセルトリ細胞の機能が低下し、精巣の保護機能が低下した結果、自己抗体が認められるようになったと考えられる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

アルコールとニコチンにおける同時曝露は精巣においてアルコール、ニコチンの両薬物の影響を相加的に受けているおり、精巣の免疫環境にも影響を与えることが本年度の結果により示唆された。これまでの報告によるとアルコールの投与ではセルトリ細胞にマイトファジーなどの保護機能が働き、セルトリ細胞障害が誘発されなかったが、ニコチンと同時曝露によりこの保護機能に影響を与えセルトリ細胞障害を生じさせることが示唆された。しかしながら、実験計画の遅延によりこれらの機序および精巣免疫への影響の程度は明らかにできていない。したがって、実験的自己免疫精巣炎（Experimental autoimmune orchitis: EAO）モデルマウスを用いて同時曝露における精巣内の免疫環境の変化を取り急ぎ行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

2021年度は、同時曝露による精巣内微細環境の変化をさらに解析していく。2020年度の結果により、同時曝露により精巣内の免疫環境が変化していることが示唆された。この変化をより明らかにしていくために実験的自己免疫精巣炎（Experimental autoimmune orchitis: EAO）モデルマウスを用いた実験を行う予定である。このモデルマウスは、雄性生殖細胞(TGC)のみを14日間隔で2回、皮下注射を行うモデルであり、1回の皮下注射で炎症が生じる場合は抗原曝露前から精巣の免疫機構に乱れが生じている証明となる。単独投与と同時曝露したマウスに同系のTGC(1×10７cells/mouse)を1回皮下注射する。40日後各群の精巣内炎症細胞浸潤と精子形成障害について、TGCを14日間隔で2回皮下注射したEAO群と比較し、またその差を分析する。免疫組織化学染色や免疫電顕、リアルタイムRT-PCRなどを用いてサイトカイン産生や生殖細胞に対する自己抗体産生を詳しく解析する。
また、アルコール群、ニコチン群および同時曝露群の精巣において全体的に酸化ストレスが強くかかっていることが分かっている。これらの酸化ストレスはアルコールおよびニコチンを代謝する際に発生する活性酸素によって生じる可能性が高い。アルコールやニコチン、アセトアルデヒドを代謝する代謝酵素はライディッヒ細胞や精母細胞などに多く含まれることから細胞ごとの薬物感受性、代謝による酸化ストレスの影響を細胞ごとの定性的な評価として免疫組織化学染色などを用いて解析する予定である。これによりアルコールおよびニコチンが精巣内のどの細胞に強く影響を与えるかを明確にしていく。

Causes of Carryover

コロナウィルス感染増加に伴う影響のため、試薬及び実験動物の購入や飼育に制限がかかり大幅な実験計画の遅延と変更を余儀なくされた。次年度は、アルコールおよびニコチンにおける同時曝露によるモデルマウスを用いた解析を予定しているため、未使用額はその経費に充てることとしたい。