卵巣キスペプチンの周排卵期における機能形態学的解析 ～臨床応用への分子基盤確立～

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18711
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 村川 裕子 日本医科大学, 医学部, 助教 (80465286)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: キスペプチン / 卵巣 / メスラット / 排卵

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、排卵誘起に関わる神経ペプチドであるキスペプチンを排卵誘発剤として使用したときの、卵巣への影響を検討することを目的とした。
最初に、周排卵期卵巣におけるキスペプチンとその受容体の発現変化を解析するため、卵巣におけるキスペプチンの免疫組織化学的手法を確立することにした。まずは成熟した雌ラットの卵巣を用いて、キスペプチンの染色条件について抗体濃度、抗原賦活化の方法、抗体反応時間について検討した。成熟した雌ラットについては、過去に報告されている結果と一致する染色像が得られたので、続いて通常のhCGでLHサージを誘導した過排卵モデルラットにて、卵巣のキスペプチンの発現について検討した。生後24日齢の雌ラットにPMSGとhCGを投与し、過排卵処理したモデルを作成した。hCG投与後から4時間後に、両側卵巣摘出とホルモン測定のための血液採取を行った。片方の卵巣は遺伝子解析するため凍結保存し、もう片方の卵巣をパラフィン固定した。パラフィン固定した卵巣にて、抗キスペプチン抗体を用いて免疫染色を行ったが、免疫染色について安定した結果が得られなかった。そのため、抗キスペプチン抗体を用いた染色方法について再検討すると同時に、他の抗体を用いて染色法に問題がないかを検討することにした。現在、卵巣の免疫染色法が確立されているエストロゲン受容体αと、排卵後に発現するプロゲステロン合成酵素系のStARの免疫染色を検討するために、準備を行っているところである。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究に対するエフォート25%が維持できていない。また、当初確実と思われていた通常のhCG投与ラットにおける免疫染色が不安定であり、予定より遅れている。
今後、計画を修正して実験を進めていく。

Strategy for Future Research Activity

通常のhCGでLHサージを誘導したラット卵巣におけるキスペプチンの免疫染色法を確立する。
その後、キスペプチンでLHサージを誘導したラットを作製し、キスペプチンおよびキスペプチン受容体の局在を組織細胞化学的に明らかにする。採取した血液では、血漿LH値、 FSH値、エストラジオール値、プロゲステロン値の推移を比較解析する。
また、卵巣よりRNAを抽出し、プロゲステロン合成酵素系と血管新生因子の発現をリアルタイムPCRで定量し、黄体形成・機能に対する影響を比較解析する。
PCOSモデルラットで同様のパラメータを解析する。

Causes of Carryover

計画どおりに実験が進められず、消耗品を購入ができずに残高が生じた。
令和元年度にできなかった実験を追加で行い、消耗品の購入に充てる予定である。