2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K18734
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
吉田 崇正 九州大学, 医学研究院, 共同研究員 (50600912)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 蝸牛 / 聴覚 / 電気生理 / ラセン靱帯 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
内耳蝸牛の内リンパ液高電位（EP）とK循環は聴覚に必須の特性で、蝸牛側壁のイオン輸送に立脚し、その破綻は難聴を惹起する。蝸牛側壁のラセン靱帯の細胞成分である線維細胞（SLF）は、in vivoにおいてNa依存性の正の静止膜電位（約+10 mV）を持ち、これがEPの成立に不可欠である。SLFには正の膜電位を生み出すNaチャネルがあると想定され、難聴の病態に関与している可能性がある。その分子同定のための電気生理実験が本研究のテーマである。
研究初年度には、ラットのラセン靱帯のスライスパッチクランプ実験を行い、SLFのホールセル記録に成功した。しかし長時間の酵素処理による細胞障害が強く、実験の成功率・安定性が非常に低い、記録細胞のサブタイプ同定のための免染反応が失われる、という問題を克服できなかった。そこで、酵素処理を要しない新たなin vitro実験系を立ち上げた。急速単離したラセン靱帯組織にパッチクランプよりも細い微小電極を挿入して細胞内記録を行った。実測されたSLFの静止膜電位は、in vivoで記録されるよりも大きな正電位（+20～30 mV）で、そのイオン感受性はNa選択的だった。この結果は、SLFのNaチャネルという仮説に合致する。細胞内記録法は、パッチクランプのように細胞内環境をコントロールしたり膜電流を実測したりすることは困難だが、蝸牛単離後10分余りで測定を開始できる。24時間以上の高濃度の酵素処理を要するスライスパッチクランプと比べて成功率・再現性が大きく改善し、膜電位のイオン・薬物感受性に関するデータが得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本課題ではin vitroとin vivoの実験を計画している。当初予定していたスライスパッチクランプは上記問題点の解決に難渋したため、細胞内記録の実験系に切り替え、安定性・再現性の高いデータが得られた。このin vitro実験に注力したため、研究初年度にはin vivo実験は行っておらず、第2年度に行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述のin vitro細胞内記録の系に分子生物学的手法を組み合わせ、Naチャネルの分子同定を目指して実験を継続する。また、EP測定などのin vivo実験を再開し、in vitroのデータとの整合性を検証する。
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