2020 Fiscal Year Research-status Report
CD8陽性Tfh細胞が関わる慢性炎症性疾患の病態メカニズムの解明
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19K18776
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
村山 公介 札幌医科大学, 医学部, 研究員 (20825418)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 慢性炎症性疾患 / IgG4関連疾患 / IgG4関連涙腺・唾液腺炎 / Tfh細胞 / CD8陽性Tfh細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、慢性炎症性疾患の1つであるIgG4関連疾患の顎下腺病変部に存在している、CD8陽性濾胞ヘルパーT細胞(CD8+Tfh)の機能を解析し、同疾患におけるCD8+Tfhの役割を明らかにすることであり、最終的に同疾患の新規治療法の開発につなげることを目指している。現時点での研究実績は以下の通りである。
①IgG4関連涙腺・唾液腺炎(IgG4-DS)患者の顎下腺組織からTfh細胞を抽出し、マイクロアレイで遺伝子発現を解析した(対照には口蓋扁桃のTfh細胞を使用)結果、IgG4-DS患者のTfhで細胞傷害性T細胞(CTL)関連分子が高発現していることを発見し、PCRおよびフローサイトメトリーでCD8+Tfhの存在を確認した。
②CD8+TfhはIgG4-DS患者の顎下腺組織の他、小児扁桃にも高率に存在していることを新たに発見した。扁桃のCD8+TfhもIgG4-DS患者のCD8+Tfhと同様にCTL関連分子を高発現していることを確認した。
③扁桃のCD8+TfhとCD8陰性Tfh細胞(CD8-Tfh)をそれぞれB細胞と共培養し、培養上清中のIgGをELISA法で定量したところ、CD8-Tfhと比較してCD8+TfhとB細胞の共培養上清でIgGの減少を認めた。また同上清中のグランザイムB(GZMB)をELISA法で定量したところ、CD8+Tfh単独培養した上清と比較して、B細胞との共培養上清でGZMBが減少していることを確認した。さらに共培養するB細胞をナイーブB細胞とメモリーB細胞に変更し、同様の共培養実験を行ったところ、IgG減少とGZMB減少はメモリーB細胞との共培養でより顕著であることを確認した。
④活性化した CD8-TfhをIL-2とIL-7で刺激し培養を行うとCD8+Tfhが一部出現することをin vitroで確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、IgG4関連疾患の診断目的で生検した顎下腺組織と手術で摘出した口蓋扁桃組織を主に使用している。検体が安定して提供頂けるかが本研究の進捗で最も重要なポイントとなるが、当研究室は札幌医科大学附属病院耳鼻咽喉科および5か所の共同研究施設の耳鼻咽喉科から臨床検体提供を受けているため、新型コロナウイルス感染症の流行による影響が多少あるものの現在まで着実に研究を進めることができている。
また、本研究では主にFACSを使用して細胞の機能解析および単離を行っているが、本学の教育機器センターには大型機器（FACS Canto、FACS Ariaなど）が複数配備されているため、大型機器のトラブルなどで実験が中断されるリスクが比較的低いことも計画通りに進行している要因であると考えられる。
しかしながら、新型コロナウイルス感染症のさらなる流行に伴い、今後十分な臨床検体が得られない状況に変わる可能性も否定できないため、今後の研究進捗が遅れてしまう懸念がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在継続して行っている実験は、CD8+TfhとメモリーB細胞の共培養の系で、実際に細胞傷害がみられるかをFACSで示せるようにKilling Assayを行っている。また、病変部のCD8+Tfhと扁桃のCD8+Tfhの違いについて考察を深めるため、両者をマイクロアレイで比較し、PCRおよびFACSでvalidationを行っている。これらのデータが揃い次第、データをまとめ論文化する予定である。
本研究の結果から、CD8+Tfhは慢性炎症環境下でCD8-Tfhより分化誘導される新規のTfh細胞サブセットであり、メモリーB細胞を標的細胞として細胞傷害能を発揮することで、結果としてメモリーB細胞からのIgG抗体産生を抑制し過剰な免疫応答を抑制していると考えられた。IgG4関連疾患においては、CD8+Tfhは病勢を収束させるように機能していると考えられた。
CD8+Tfhは小児扁桃にも存在しているが、その役割についてはまだ不明である。今回我々が発見した、自己メモリーB細胞に対する細胞傷害能を有する新規Tfh細胞サブセットは、新たな抗体産生メカニズムの調節機構を担っていると考えられ、液性免疫を考える際の新たな切り口となることを期待している。
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