2020 Fiscal Year Research-status Report

Role of IL-25 and iILC2 in chronic severe allergic conjunctivitis

Research Project

Project/Area Number	19K18891
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	浅田洋輔順天堂大学, 医学部, 助教 (70596626)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	アレルギー性結膜炎 / ＩＬＣ２ / ＩＬ－３３ / 線維芽細胞 / IL-25
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的はアレルギー性角結膜炎における慢性化および重症化におけるIL-25の役割を明らかにすることである。申請者は、ブタクサ花粉誘発アレルギー性結膜炎モデルマウスにおいてIL-33が病態形成に重要であること、さらにはパパイン吸着ソフトコンタクトレンズをマウスに装用させて、自然免疫依存性のアレルギー性角結膜炎モデルを樹立したところ、IL-33, TSLPならびにILC2が病態形成に必須であることを報告した。しかし、これらの急性期アレルギー性結膜炎マウスモデルではIL-25欠損マウスと野生型マウスとの間で炎症の程度に差はみられなかった。しかしながら、IL-25がアレルギー性鼻炎の慢性化・重症化に関与していること、IL-25刺激によってiILC2が誘導され、IL-25とtuft細胞との協調作用でアレルギー性炎症が増強されるといった報告があり、IL-25はアレルギーにおいて慢性炎症に関与していることは大いに眼が得られた。これまでにIL-25と慢性重症アレルギー性角結膜炎の病態成立との関連を調べた先行研究はないため、IL-25シグナルがアレルギー性角結膜炎の慢性化ならびに重症化に重要ではないかとの仮説を着想し、新たに慢性アレルギー性結膜炎モデルを作成した。 Tuft細胞との関連はこれまで検討したことがなく、非特異的染色と解釈されてきた結果の中にIL-25陽性Tuft細胞が結膜上皮内に存在していた可能性がある。そこで、Tuft細胞のマーカーである抗-DCAMKL1抗体とIL-25抗体を用い、結膜におけるTuft細胞の局在ならびにIL-25染色を行い、慢性アレルギー性結膜炎マウスモデルのマウス結膜にはIL-25並びにtuft細胞が存在することが判明した。さらにはIL-25トランスジェニックマウスを作成し、現在IL-25の機能を解析している（投稿準備中）
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究では以下の３つの目標を設定しており、①に関しては予定通り進行している。②、③に関しても順次実験を行っているが、本年度では解析までは行えなかった。 ①アレルギー性角結膜炎におけるIL-25発現の局在の再検証 ②IL-25シグナルを増強したマウス慢性重症結膜炎モデルの作成 ③網羅的遺伝子発現解析(sc-RNAseq)を用いたILCサブタイプの同定と角結膜炎モデルにおける役割の評価 ②に関しては慢性アレルギー性結膜炎マウスモデルはすでに作成の手順は整っているため、今後角結膜上皮細胞に発現するケラチン１４のプロモーターを用いて IL-25遺伝子トランスジェニックマウスをBALB/c背景で作成。このマウスを用い、実験の継続を行っていく。③に関しても同様であり、マウスモデルは確立しているため、順次実験を行い解析を進めていく。
Strategy for Future Research Activity	慢性重症アレルギー性角結膜炎の病態にIL-25シグナルと、それによって活性化されるILC2、ならびにNMUシグナルがどのように関連しているかを明らかにするため、それらのシグナルを増強した状態で、ヒト慢性重症アレルギー性格結膜炎VKC/AKCに似た症状・所見を伴うマウス結膜炎モデルを樹立は成功している。角結膜上皮細胞に発現するケラチン１４のプロモーターを用いてIL-25遺伝子トランスジェニックマウスをBALB/c背景で作成したため、このマウスを用い、アレルゲンとしては、精製ダニ抗原とブタクサ花粉、並びにその混合物を皮下免疫し、7日後から結膜増殖反応が得られるまで点眼刺激を継続する。（結膜組織の増殖反応はヒトVKC/AKCにおける特徴的な病理変化であり、今回のマウスモデルにおいても慢性化・重症化の重要な指標である）。慢性重症モデルの成否は結膜増殖反応の他に、結膜の充血、腫脹、流涙といったクリニカルスコア、好酸球浸潤数および結膜組織中の炎症性サイトカインを定量による重症度の評価を元に行う。網羅的遺伝子発現解析(sc-RNAseq)を用いたILCサブタイプの同定と角結膜炎モデルにおける役割の評価マウスアレルギー性角結膜炎の発症において、ブタクサ花粉を使用した急性モデルにおいてはIL-33とその下流にあるnatural ILC2(nILC2)が重要な役割を果たしている。一方慢性モデルにおいては我々の仮説が正しければIL-25とiILC2の働きが重要と考えられる。急性モデル、慢性モデルから結膜組織を採取し、FACSを用いてILC2細胞分画を分取、single cell (sc)-RNA seqの手法で、アレルギー性角結膜炎発症時における結膜ILC2細胞をクラスタリングし、急性モデル、慢性モデルにおけるnILC2, iILC2の役割を明らかにする。
Causes of Carryover	コロナウイルの蔓延により実験が予定通り行えず、計画に遅れが生じているため、また国際学会に参加する予定であったが、コロナウイルスの蔓延により参加が不可能であったため。