2019 Fiscal Year Research-status Report
骨細胞のPTH応答性を利用した、新たな骨リモデリング調節因子の探索
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19K18948
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Research Institution | Meikai University |
Principal Investigator |
林田 千代美 明海大学, 歯学部, 助教 (40710900)
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Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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Keywords | 骨細胞 |
Outline of Annual Research Achievements |
令和元年度(初年度)の計画では、① まず、「骨細胞にPTHを作用させた場合に発現の増加する因子があるのか、それは既知の因子か、それとも、PTHの作用により初めてその発現がみられるか亢進するというような未知の因子か」について調べる。In vitroでOEBFs(マウス大腿骨片中に埋まった骨細胞)にPTHを作用させる群とさせない群をつくり1日培養後、OEBFsのRNAを抽出し、マイクロアレイ解析(タカラバイオ社に委託)を行い遺伝子発現を網羅的に解析する。② ①の結果を踏まえ、PTHに応答して発現の増加した遺伝子すべて(あるいは遺伝子数が多すぎる場合には文献調査等から10個に絞った遺伝子)について、mRNA発現量、タンパク質発現量を調べる。そして、各遺伝子の発現量を比較・検討する というものであった。 当該年度、実際には、In vitroでOEBFs(マウス大腿骨片中に埋まった骨細胞)の培養から得られたRNA量が少ない事象が続いたため、外注委託のマイクロアレイ解析は先送りとした。代わりに、OEBFsにPTHを作用させる群とさせない群をつくり1日培養後に得られたRNA量が安定した回に、骨細胞に発現する因子として既知のもの(SOST、RANKL、DMP1、FGF23、OPG等)について、Real-time RT-PCR法により、研究室内の手持ちのプライマーを用いて、mRNA発現量を調べる実験を繰り返した。 本研究は、初年度秋頃の学会シーズンには、発表できるデータがなかったため、学会発表を見送った。他、本研究内容について論文等の発表はなかった。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予定では、マイクロアレイ解析→Real-time RT-PCR法分析の順番で、骨細胞に発現する既知の因子と未知の因子について調べる予定であった。しかし当該年度、実際には、in vitroでOEBFs(マウス大腿骨片中に埋まった骨細胞)の培養から得られたRNA量が少ない事象が続いたため、外注委託のマイクロアレイ解析は先送りとした。代わりに、OEBFsにPTHを作用させる群とさせない群をつくり1日培養後に得られたRNA量が安定した回に、骨細胞に発現する因子として既知のもの(SOST、RANKL、DMP1、FGF23、OPG等)について、Real-time RT-PCR法により、研究室内の手持ちのプライマーを用いて、mRNA発現量を調べる実験を繰り返した。まだマイクロアレイ解析を行っていないため、得られたデータが、Real-time RT-PCR法によって得られた骨細胞に平常時発現することが既に知られている遺伝子についてのPTH作用時の発現状態のみであるため、研究の進捗状況はやや遅れている。
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Strategy for Future Research Activity |
株化細胞ではない初代骨細胞のin vitro研究は、初代骨細胞が骨基質中に埋め込まれて存在するため培養が難しいことが知られている。培養自体が毎回の実験で必ず成功するとは限らず、不安定さがあるのが、この骨細胞の実験の特徴でもあるため、遅れているが、前向きに実験に取り組んでいくことで、今後の研究が進んでいくと考える。 2年目には、必ずマイクロアレイ解析を行い、OEBFs(マウス大腿骨片中に埋まった初代骨細胞)にPTHを作用させた場合に発現の増加する因子があるのか、それは既知の因子か、それとも、PTHの作用により初めてその発現がみられるか亢進するというような未知の因子かについて調べる。そしてその結果を踏まえ、PTHに応答して発現の増加した遺伝子すべて(あるいは遺伝子数が多すぎる場合には文献調査等から10個に絞った遺伝子)について、mRNA発現量、タンパク質発現量を調べ、各遺伝子の発現量を比較・検討する。これを進めた後、次の実験段階として、PTHに応答して骨細胞での発現が増加する因子の骨形成促進能と骨吸収抑制能について検討するための実験を行う方策である。
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Causes of Carryover |
交付された直接経費の使用予定の内訳は物品費60万円、旅費10万円、その他(外注のマイクロアレイ費用)60万円であった。実験を開始したところ、in vitroでOEBFs(マウス大腿骨片中に埋まった骨細胞)の培養から得られたRNA量が少ない事象が続いたため、60万円と高額な外注委託のマイクロアレイ解析は先送りとした。初年度は、外注のマイクロアレイ解析を先に行わず、得られるRNA量が安定するのを確認しながら研究室の共用のプライマーと試薬も併用しながらの予備的なReal-time RT-PCR法でOEBFsにPTHを作用させたときの既知の因子の遺伝子発現変化を調べたため、物品の購入が少なかった。当初の予定通りに学会には参加し骨代謝研究の最新知見を得たが、研究の進捗状況がやや遅れており本研究テーマについてのデータ発表は行わなかったため、旅費の請求は遠慮した。以上の理由から次年度使用が生じたが、外注委託のマイクロアレイ解析を行い、実験を進め使用していきたいと考えている。
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