Analysis of VEGF-A/VEGFR-2 autocrine loop in oral cancer cells

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18977
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 川邊 睦記 兵庫医科大学, 医学部, 研究生(研究員) (10760720)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: VEGF-A / VEGFR-2 / Autocrine

Outline of Annual Research Achievements

VEGF-A（血管内皮細胞増殖因子）はがん細胞から分泌され，腫瘍血管新生を誘導することで，がんの生存と転移を促進することが知られている．VEGF-Aが結合する受容体として，内皮細胞に存在するVEGF Receptor 2（VEGFR-2）が挙げられ，VEGFR-2は血管新生に関与すると考えられている．今回我々は，患者より樹立した扁平上皮癌細胞（HCM-SCC001）を用いてVEGF-AとVEGFR-2の増殖への役割を評価した．
RT-PCR法、蛍光免疫染色法および免疫組織染色法にて，HCM-SCC001細胞および由来組織におけるVEGF-AとVEGFR-2の発現を確認した．免疫組織染色法では，原発巣および転移リンパ節において同様にVEGF-AとVEGFR-2の発現を確認できた．VEGF-A存在下でHCM-SCC001細胞を培養し、Cell Count Kit-8にて増殖に与える影響を評価したところ，VEGF-A存在下でHCM-SCC001細胞を培養した．VEGF-A非存在下と比較し、優位に増殖した（P < 0.05）。またRealtime PCR法では、VEGF-A存在下にて48時間後のVEGFR-2の発現は優位に上昇した（P < 0.05）．
Anti-VEGFR2存在下でHCM-SCC001細胞を培養し，Cell Count Kit-8にてVEGFR-2が細胞増殖能に与える影響を評価した．さらに，VEGFR-2のBlockによりVEGF-Aの発現および産生が抑制されていることをRealtime PCR法およびElisa法にて評価した． Anti-VEGFR-2存在下で120時間後のHCM-SCC001細胞の増殖は抑制された（P < 0.05）．同様にELISA法においてもVEGF-Aの産生低下を確認できた（P < 0.05）．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

RT-PCR法、蛍光免疫染色法および免疫組織染色法にて，HCM-SCC001細胞および由来組織におけるVEGF-AとVEGFR-2の発現を確認した．免疫組織染色法では，原発巣および転移リンパ節において同様にVEGF-AとVEGFR-2の発現を確認できた．VEGF-A存在下でHCM-SCC001細胞を培養し、Cell Count Kit-8にて増殖に与える影響を評価した．Anti-VEGFR2存在下でHCM-SCC001細胞を培養し，Cell Count Kit-8にてVEGFR-2が細胞増殖能に与える影響を評価した．さらに，VEGFR-2のBlockによりVEGF-Aの発現および産生が抑制されていることをRealtime PCR法およびElisa法にて評価した．

Strategy for Future Research Activity

現在，recombinant VEGF-A存在下でHCM-SCC001を培養し，細胞上清よりExoQuick（System Biosciences社）を用いてエクソソームを回収する実験を行っている．今後，回収したエクソソームをExoELISA（System Biosciences社）を用いて定量し，EV-Entry System（System Biosciences社）を用いて細胞内へのエクソソームの取り込み効率を向上させた状態で回収したエクソソーム存在下で，腫瘍細胞自身のエクソソームが影響するかを評価する．

Causes of Carryover

実験自体はおおむね順調に推移していたが，残額が生じてしまった．今後エクソソームに関する実験では高額な試薬購入費が必要となるため，次年度使用予定である．