恒常性調節型M2マクロファージによる口腔粘膜病変の抑制法

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18978
• Research Institution: Fukuoka Dental College
• Principal Investigator: 瀬野 恵衣 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 助教 (60780426)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: Th1型免疫応答 / 口腔粘膜疾患 / M1マクロファージ / M2マクロファージ / 極性転換 / 免疫機能調節 / エフェクター細胞

Outline of Annual Research Achievements

Th1型口腔粘膜疾患モデルの検索において、初期病変おいてM1マクロファージがエフェクター細胞として、上皮親和性機序を発揮して病変の発症ならびに進行に重要であることが明らかにした。その中で、興味深い結果は、口腔粘膜局所の恒常性維持に関与している組織マクロファージであるM2マクロファージの不活性化である。本年度は、in vitroでの免疫調節機能による恒常性維持を担っているM2マクロファージの抑制機構を主体に検討を行った。検索にはナイーブ・マクロファージとしてRaw264.7(RAW細胞）を使用した。先ず、同細胞からM1ならびにM2マクロファージの誘導を試みた。M1マクロファージ（M1-RAW)の誘導にはLPSあるいはIFNg刺激を用い、M2(M2-RAW)にはIL4刺激により誘導を行った。M1およびM2の性状は、サイトカイン・プロファイルおよび細胞表面マーカーの発現により確認した。また、機能面の検索には、M1-RAWあるいはM2-RAWとナイーブRAW細胞をTranswellチャンバーを介した共培養して、RAW細胞のM1あるいはM2の極性転換を示すことにより判断した。Th1型口腔粘膜疾患モデルにおけるM2マクロファージの不活性化をin vitroで再現するために、同疾患モデルの口腔粘膜病変に浸潤しているM1マクロファージ（pM細胞）を単離し短期間培養を試みた。具体的な方法としては、pM細胞とM2-RAW細胞の共培養を行い、M2-RAW細胞の性状変化について検索した。さらに、pM細胞の培養上清をM2-RAW細胞の培地に添加して細胞の動態変化を検討した。その結果、共培養および上清添加の両群でのM2-RAW細胞は、M2としての極性が抑制される傾向を示した。in vivoの現象を再現することが可能であった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は、モデル病変の発症に関与するM1マクロファージと粘膜の恒常性維持に関与するM2マクロファージの相互作用についてin vitroで検討を行った。その結果、エフェクター細胞であるM1マクロファージの活性化がM2マクロファージの極性転換を促し、M2の機能を発揮できずに粘膜での恒常性が破綻することが推測された。in vitroでの病変発症の現象再現は、仮説で挙げていたM1マクロファージによる組織マクロファージの不活性化誘導を明らかにしたものであり、意義のある結果であると考える。しかしながら、予定としては恒常性調節型M2マクロファージの人為的作製であり、この点に関しては結果が得られなかった。遅延の原因としては、コロナ対策による研究時間の制限が大きかったと思われる。次年度には、研究時間を確保して遅れを取り戻したいと考える。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、本年度の計画に含まれていた恒常性調節型M2マクロファージを人為的に作製することから始める。この人為的作製については、本年度もM2-RAW細胞を作製しているが、この細胞はpM細胞からの影響を受けて極性を転換させてします。人為的な恒常性調節型M2マクロファージは、Th1型免疫応答を抑制できる機能を発揮するM2マクロファージを意味しており、その開発に力を注ぐ。具体的には、M2-RAW細胞はRAW細胞をIL4刺激することにより誘導したが、これでは力不足である。そこで、修復機能に優れている間葉系幹細胞（MSC）からM2型細胞の誘導を試みる。すなわち、MSC細胞をIL4およびM-CSFで刺激をしてM2-MSC細胞を誘導作製したいと考える。pM細胞からの培養上清に対するM2-MSC細胞の反応性を検索する。その結果、M1への極性転換が抑えられれば、M2-MSC細胞はTh1型免疫応答に対応できると考えられる。そこで、M1-RAW細胞とM2-MSC細胞の共培養により、M1-RAW細胞の極性転換が誘導できるかを検証して、人為的に作製した恒常性調節型M2としての評価を定めたいと考える。これらの基礎データを用いて、動物モデルに応用してin vivoでのTh1型口腔粘膜疾患の発症・進行の抑制法として研究を進めて行きたい。

Causes of Carryover

コロナ対策で研究時間の制限が掛かったために、予定していた試薬などの購入が出来なかったため。繰越し分は、次年度、計画的に執行する予定である。