未分化細胞から骨細胞への分化過程を制御する遺伝子群の機能的解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K19008
• Research Institution: Tokyo Dental College
• Principal Investigator: 鈴木 瑛一 東京歯科大学, 歯学部, 非常勤講師 (50778503)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 骨細胞分化 / マイクロアレイ

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，Cre/loxP 発現制御システムを利用した遺伝子改変マウスを利用して，骨細胞特異的にEGFPを発現させたマウスを用いることにより，間葉系幹細胞から骨細胞への分化過程において特異的に発現する遺伝子の解明を目指す。加えて同マウスからiPS細胞を樹立し，骨系細胞分化時の変動遺伝子を詳細に解析することで，未分化細胞から骨細胞への分化・維持機構および，機能の制御機構の全容を明らかにすることを目的としている。
本年度は骨細胞特異型 EGFP発現マウスの作成を行い，遺伝子改変マウスより骨髄間葉系幹細胞 (BMSC) の採取ならびに骨細胞様細胞への分化誘導を行ったのち、FACSを用いたフローサイトメトリーにて骨細胞様細胞の単離とDNAマイクロアレイによる遺伝子解析を行った。
マイクロアレイでは，EGFP陽性細胞 (骨細胞様細胞)とEGFP陰性細胞とを比較したところ，骨分化に関係するいくつかの遺伝子発現パターンが記録された。中でも骨分化関連シグナルとして知られているWnt signaling関連遺伝子のUp regulateが認められた。また，統計解析により複数の転写因子で有意な遺伝子発現上昇が認められ，これらの発現変動遺伝子の骨細胞への分化への関与が示唆された。
現在Real-time PCRにて詳細なmRNA発現量の解析を行っている。今後はデータをまとめ、骨分化関連遺伝子についての評価をしていく。
さらに，遺伝子改変マウス皮下組織より線維芽細胞を得たのち，Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycの4遺伝子を導入し，iPS細胞様の形態をもつコロニーを確認した。現在PCR法による未分化性の確認をおこなっている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

おおむね順調であるが，新型コロナウイルスの影響により，動物舎への制限ならびに研究時間の制限などから，遺伝子改変マウスの出産，交配が一時的に中止された。さらに骨髄間葉系幹細胞の骨系細胞への分化誘導などに時間を要した。 現在では継続的に遺伝子改変マウスの作成を行っており，マイクロアレイも問題なく行った。

Strategy for Future Research Activity

現在マイクロアレイの結果を解析しており，骨細胞分化のKeyとなると予想されるいくつかの遺伝子をピックアップしている。今後はピックアップした遺伝子群について，Real-time PCRにてさらなる詳細なmRNA発現量の解析を行う。
さらに，iPS細胞に関してもPCR法による未分化性の確認をおこなった後に骨分化誘導を行い，既存細胞と同様の遺伝子発現がおこなわれるかどうか比較・検討する。

Causes of Carryover

おおむね使用は計画通りおこなわれたが、今年度行う予定であった学会発表次年度に持ち越したことなどから、次年度使用額が生じた。
今年度では国内外の学会での情報収集や研究発表を予定しており、その費用を計上している。