2019 Fiscal Year Research-status Report
ミュータンスレンサ球菌表層タンパクの病原性解析に基づく齲蝕予防法の開発
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19K19033
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Research Institution | Kagoshima University |
Principal Investigator |
勝俣 環 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 助教 (70812288)
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Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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Keywords | Sortase / Streptococcus mutans |
Outline of Annual Research Achievements |
Streptococcus mutans(以下 S. mutans)はう蝕原性細菌であり、菌体表層タンパク質の局在に関与する酵素のひとつとしてSortaseという酵素を保有している。本研究では、Sortase依存的に菌体表層へ局在化する6種類のタンパク(WapA, FruA, SpaP, WapE, GbpC, DexA)の網羅的解析を行い、歯科材料表面の定着に関与するタンパクを同定し、う蝕予防に利用することを目的とする。 最初に、Sortase遺伝子、その他表層タンパク6種の計7種類について遺伝子欠損株を作製した。S. mutans実験株UA159を親株とし、相同組み換えであるダブルクロスオーバー法にて、遺伝子欠損株を作製した。これら作製した欠損株を用いて、性状解析を行った。 第一に、初期付着能の検証を行った。付着試料としては、細胞付着用プラスチック製カバースリップを用いた。試料に唾液ペリクルを付着させ、菌液に1時間浸漬し、付着した菌数をコロニー計測法にて測定した。検証の結果、Sortase遺伝子欠損株、SpaP遺伝子欠損株では野生株と比較して付着能の大幅な減少を認め、GbpC遺伝子欠損株、DexA遺伝子欠損株についても減少を認めた。 第二に、唾液凝集能の検証を行った。唾液と菌液を攪拌し、濁度の変化を分光光度計にて測定した。 検証の結果、Sortase遺伝子欠損株、SpaP遺伝子欠損株において、野生株と比較し凝集能の有意な減少を認めた。 第三に、プラーク形成の中心菌であるFusobacterium nucleatumとの共凝集能の検証を行った。2種の菌液を攪拌し、濁度の変化を分光光度計にて測定した。検証の結果、野生株と各遺伝子欠損株の間に有為差は認めなかった。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
遺伝子欠損株を作製し、Sortase依存性タンパクの性状解析を行っていくことについては順調に進行している。また、いくつかのタンパク欠損株においては野生株とは異なる表現型を示しており、う蝕発生への関与が示唆された。 当初は関連が疑われるタンパクについては、ペプチド、抗体の作製を行う予定であった。リコンビナントタンパク発現用プラスミドを用いて、各表層タンパクをコードする遺伝子をクローニングし、6種のSortase依存性タンパクについて各々大腸菌発現株を作製した。いずれも遺伝子発現については確認されたが、タンパク発現が確認できない状況である。
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Strategy for Future Research Activity |
Sortase依存性タンパクの性状解析について、引き続き検証を行う。特に初期付着能については、現在行っている細胞付着用プラスチック製カバースリップに加え、付着試料として歯冠修復材料の使用を予定する。 作製が成功していないペプチド、抗体作製については、条件を変更し再検証を行う。対策として、表層タンパクの機能領域を遺伝子データベースにて検索し、作製する領域を小さくすることで、タンパク発現株の作製を試行する。 また、表層タンパクの二重遺伝子欠損株を作製し、更なる解析への使用を予定する。
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Causes of Carryover |
産前産後休暇、育児休業取得に伴い、2019年12月から2022年3月まで研究を中断している状況である。年度途中の中断に伴い、次年度使用額が発生した。 研究再開に伴い、試薬・材料の購入等に助成金を使用する。また、補助事業期間延長の申請を予定している。
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