2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of Osteoporosis Treatment Nano-vehicles via Apoptotic Cell Inspired Materials
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19K19045
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
中川 泰宏 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 特別研究員 (90831264)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 骨粗鬆症 / IL-2 / アポトーシス細胞 / ホスファチジルセリン / 免疫寛容 / 高分子ミセル / リウマチ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
関節リウマチ(RA)は近年よく見られる自己免疫疾患であり、発症部位での軟骨や骨の粗鬆化に加え、全身性の骨粗鬆症を誘発することが知られている。RAでは炎症部位で産生されるTNF-alphaやIL-10などの炎症性サイトカインが破骨細胞の分化成熟を誘導することで骨・関節の破壊が進行する。加えてこれらの炎症性サイトカインは血流によって全身に行き渡るため、RA発症部位以外での骨組織の粗鬆化が誘引される。これらの炎症性サイトカイン産生・破骨細胞の分化誘導を担っているのがそれぞれ炎症性の発現型に分極したM1型マクロファージと、Th17やTeff型のT細胞である。今日のリウマチの治療法は、抗炎症性の低分子薬による治療か、抗体を用いた炎症性サイトカイン阻害の二種である。これらの治療法では病巣の根本治療は難しく、患者の体・金銭的負担が非常に大きい。以上を踏まえて申請者は、恒常的な免疫活性状態にある免疫細胞を抑制型への分極を誘導する技術を開発することで、リウマチの根本治療と骨粗鬆症回復の大きな助けになると予想した。本研究ではこれを達成するための材料として、アポトーシス細胞が有する抗炎症活性を有したmRNAキャリアを考案した。本研究では、アポトーシス細胞模倣高分子がマクロファージの発現型をM2型に誘導すると同時に、Tregを誘導するサイトカインであるIL-2産生誘導mRNAを使用することで、T細胞の免疫を抑制する戦略である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成31年度(令和元年度)では、mRNAキャリアとなるPS-PEG-P(GE[Trp])、及びPEG-(GE[Trp])の合成検討を行った。PS-PEG-P(GE[Trp])を合成するためには前駆体であるPS(Boc/t-Bu)-P(BnGE)のBn基を脱保護する必要があったが(図1 )、Bn基の脱保護条件であるPd/C触媒を用いた接触還元法を試した所、脱保護反応が進行しなかった。これはPS基中に存在するリンが触媒毒として作用することでPd/Cを失活させてしまうためであると考え、HBrを用いた酸加水分解条件におけるBn基の脱保護反応を行った所、PS基も脱離してしまうという結果を得た。そこで、これまで作製した合成経路を1から設計し直し、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)-アジド間のクリックケミストリーを用いた合成経路を検討中である。また、PS基を含有しないmRNA担持ポリマーとして、THP-PEG-P(GE[Trp])を合成した。
作製したTHP-PEG-P(GE[Trp])とIL-2 mRNAを用いた高分子ミセルを作製した。mRNA由来のアニオンと高分子由来のカチオンをHEPES中で任意の比率で混和した所、アニオン/カチオン比が3以上の時優れたmRNA内包ミセルが作製可能であるということが明らかとなった。特に、アニオン/カチオン比が3のときにDLS測定にて短鋒性の高い均質なmRNA内包ミセルが形成できていることを確認した。
作製したIL-2 mRNA内包ミセルにおいて、マクロファージ由来細胞株RAW264.7に対するトランスフェクション効率を評価したが、mRNA内包ミセルによるIL-2産生は確認できなかった。原因としてマクロファージにおける細胞質移行が不十分であることが予測された。以上を踏まえ、エンドソーム脱出能を付加した高分子ミセルの設計を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. ジベンゾシクロオクチン(DBCO)-アジド間のクリックケミストリーを用いた合成経路によるPS基含有高分子(PS-PEG-P(GE[Trp]))を合成する。
2. PS-PEG-P(GE[Trp])に対してエンドソーム脱出能を付与した設計の高分子(PS-PEG-P(GE[Trp-His]))を合成する
3. IL-2 mRNA内包ミセルのマクロファージ(RAW 264.7)に対するトランスフェクション効率及び免疫抑制機能を評価する
4. リウマチモデルマウスに対してｍRNAミセルを尾静脈投与し、血中対流性と炎症部位集積効率を評価する。同時に、免疫染色法によって炎症部位におけるマクロファージ・T細胞の分極を確認する。
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| Causes of Carryover |
mRNA合成に多額の金額を計上していたが、安価(想定の半額)にて購入できるサービスを利用したため。また、動物実験を実施しなかったため。
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