2021 Fiscal Year Research-status Report
カテプシンKに注目した口腔扁平苔癬の上皮-樹状細胞ネットワーク機構の解明
| Project/Area Number |
19K19165
|
|---|
| Research Institution | Kyushu University |
|---|
Principal Investigator |
山内 昌樹 九州大学, 歯学研究院, 共同研究員 (60805282)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 口腔扁平苔癬 / カテプシンK / DNAマイクロアレイ / pDC / LMD法 / Th17 / TLR9 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
LMD 法によりOLP 病変上皮を選択的に抽出し、DNAマイクロアレイによる疾患関連分子の網羅的解析を行った。それにより発現上昇を認めた遺伝子(76遺伝子) のうち、Th細胞活性化に関連する分子として「カテプシンK(CTSK)」を見いだした。
OLP病変組織におけるCTSKの発現と局在の検索のため、免疫組織化学染色法を行った。その結果、OLP病変局所では粘膜上皮内と上皮直下の浸潤炎症細胞にて強い発現を認めたが、他の類似粘膜疾患(過角化症、上皮性異形成)では上皮直下の浸潤炎症細胞にのみ僅かな発現を認めた。
CTSKはpDC細胞膜上にあるTLR9を標的分子としているため、蛍光二重免疫染色法にてその局在の検索を行ったところ、上皮内および上皮直下の浸潤炎症細胞の一部に発現の一致を認めた。また、Validation(real-time PCR)を行ったところ、正常粘膜組織と比較してOLP病変組織ではCTSKのmRNA発現の亢進を認めた。 以上の結果より、OLPの病態形成にはCTSKが関与していることが示唆された。また、TLR9はCTSKを認識してIL-6やIL-23を産生しTh17細胞を活性化するため、ヒト PBMCからpDCを抽出し、pDCのみ、pDC+TLR9アゴニスト、pDC+TLR9アゴニスト＋CTSK、pDC+TLR9アゴニスト+CTSK+CTSK阻害薬でそれぞれ刺激、培養し、Th17関連サイトカイン（IL-6,IL-17,TGF-β）の産生量を比較した。その結果、他の群と比較してpDC+TLR9アゴニスト＋CTSKで優位にそれらの発現が亢進していた。また、OLP組織においてTLR9の数とTh17の数、CTSKの数とTh17の数は正の相関を認めた。
これらの結果よりCTSKはTLR9を介してpDCのTh17関連サイトカインの産生を促進することが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
伝染病の世界的流行により、本国でも不要不急の外出自粛傾向が強まった影響でサンプル採集が滞り、一定期間の実験室使用制限もあったため遅延している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
(1)カテプシンK刺激によるpDCのTh細胞活性化因子産生能の解析
ヒトpDC株にカテプシンKで刺激し、その後培養上清を採取してサイトカインアッセイを行い、 発現が亢進した可溶性分子を検索する(in vitro)。
(2)OLP モデルマウスの樹立に向けたカテプシンKトランスジェニック (Tg) マウスの作成
(real-time PCR法、免疫組織化学染色法、蛍光二重免疫染色、フローサイトメトリー)
カテプシンK Tg マウスの口腔粘膜の採取し、発赤・びらん形成の有無や病理学的所見を確認する。カテプシンK Tgマウスの口腔粘膜にOLP様病変が認められれば、さらにカテプシンK阻害薬による口腔粘膜の消炎効果も検討する予定である。このTgマウスがOLPの病態を反映することができれば、現在難航しているOLP モデルマウスの確立にもつながり、現在第一選択薬であるステロイドに代わる新しい分子標的治療にも繋がることが多いに期待される。
|
| Causes of Carryover |
本実験におけるバリデーションを行う上で十分な数の組織採集が済んでおらず、それに伴い使用額も一部未使用になっている。 次年度からも引き続き、症例数をさらに増やして、OLPの病変局所における発現と局在および臨床所見(悪性化の頻度や病型)との関連についてTissueFAXS(定量化)を用いて検討を行う予定であ る(validation)。また、ヒトpDC株にカテプシンK刺激し、培養上清を用いたサイトカインアッセイを行った実験に関しても症例数をさらに増やしてOLP モデルマウスの樹立に向けたカテプシンKトランスジェニック (Tg) マウスの作成を行う予定である。
|
