2019 Fiscal Year Research-status Report
口腔がん悪性度に関与するDLEU1の作用機構の解明とその臨床応用
| Project/Area Number |
19K19239
|
|---|
| Research Institution | Sapporo Medical University |
|---|
Principal Investigator |
畠中 柚衣 札幌医科大学, 医学部, 研究員 (60815265)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | lncRNA / 口腔扁平上皮癌 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的はDLEU1とoncogenic signalを結ぶ分子機構をさらに明らかにすることで口腔がんの新規治療法開発につなげることであり、これまでにThe Cancer Genome Atlas (TCGA)が公開している頭頸部扁平上皮がんのRNA-seqデータを解析し、がん組織において過剰発現するlncRNAを抽出、さらにその中から、DLEU1のノックダウンが口腔がん細胞の増殖、遊走・浸潤、in vivo腫瘍形成能を強く抑制することを見いだした。またDLEU1のノックダウンによりHAS3 (Hyaluronic synthase 3)、CD44、TP63の遺伝子発現が抑制され、かつTCGAデータからDLEU1発現との間に正の相関を見出した。DLEU1による遺伝子発現制御機構を解明するため、DLEU1ノックダウンがOSCC細胞のエピゲノムに与える影響を次世代シーケンサーにより解析した。その結果、転写活性化マーカーであるヒストンH3リジン27アセチル化(H3K27ac)が、DLEU1ノックダウンによって低下することが明らかになった。H3K27acが変化する遺伝子群には、インターフェロンシグナル関連遺伝子が多く含まれることから、DLEU1ががん細胞のインターフェロンシグナルに何らかの関わりを持つことが示唆された。現在、レンチウイルスベクターを用いたDLEU1過剰発現系を構築し、さらなる機能解析を進めている。ヒトゲノムにおよそ2万種類以上コードされているとされるlncRNAの大部分はいまだに機能が明らかにされておらず、口腔がんにおけるlncRNAの研究報告はいまだ非常に少ない状況である。当講座で同定した新規口腔がん関連lncRNAとしてDLEU1は口腔がんの新しい治療標的分子となりうる可能性が十分あると考えられ、研究を進める意義があると考え取り組んでいる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた研究方法の一つに、DLEU1遺伝子近傍のエンハンサー領域を探索するためエンハンサー マーカーであるヒストンH3リジン27アセチル化(H3K27ac)のChIP-seqによる解析を掲げており、前年度までに実施することができた。
また、現在までに得たDLEU1標的遺伝子データを元に、DLEU1がTP63-HA-CD44シグナルを活性化するメカニズムを探索する目的で、レンチウイルスベクターを用いたDLEU1の過剰発現系を確立し、さらなる研究を行っている途中であり、おおむね順調に進展できていると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
現段階で確立したDLEU1過剰発現系を用いてさらなる研究をすすめていく。
1.DLEU1標的遺伝子および相互作用タンパクの網羅的探索
ChIRP (Chromatin isolation by RNA purification)法により、DLEU1のゲノムDNA上の結合領 域およびDLEU1と相互作用するタンパクを網羅的に探索する。DLEU1をベイトとし、回収 したゲノムDNAをdeep sequence解析する(ChIRP-seq)。DLEU1過剰発現が遺伝子発現に与える影響をマイクロアレイで解析し、ChIRP-seqデータを統合することで、 DLEU1標的遺伝子を同定する。またChIRP法で分離したタンパクを質量分析することで、DLEU1と相互作用するタンパクを同定する。同定したタンパクが口腔がん細胞の増殖・遊 走・浸潤能に与える影響をノックダウン実験により検証する。またタンパクの細胞内局在や、 ノックダウン後の遺伝子発現プロファイルなど、機能を多角的に解析する。
2.in vivoモデルを用いたDLEU1シグナル標的治療の検証
DLEU1シグナルの治療標的としての有用性を検証するため、xenograftモデルを用いた解析を行う。DLEU1過剰発現系の口腔がん細胞株をヌードマウスに移植して腫瘍形成能の抑制効果を検証する。
|
| Causes of Carryover |
購入予定だった試薬や消耗品については、講座に前年度の残りがあり、今回新たに購入せずに実験を行うことが可能であったため次年度使用額が生じてしまった。
繰り越した額については、次年度論文投稿を控えているため、投稿料・学会費に使用する予定である。
|
