The risk analysis of staphylococcal food poisoning associated with new type of enterotoxins

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K19427
• Research Institution: Osaka Institute of Public Health
• Principal Investigator: 梅田 薫 (中田薫) 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所, 微生物部, 主幹研究員 (90332444)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 黄色ブドウ球菌 / 新型エンテロトキシン / ブドウ球菌食中毒 / 全ゲノム解析 / サンドイッチELISA / RPLA法

Outline of Annual Research Achievements

1.ブドウ球菌エンテロトキシン（SEs）は嘔吐や下痢を主症状とする食中毒を引き起こす。サンドイッチELISA法を用いて、2014年に大阪市内で発生したブドウ球菌食中毒由来菌株の新型SEs産生性および、食品残品中に含まれる新型SEs量を測定した。その結果、食中毒由来菌株はきわめて高い新型SEs産生性を示した。食品残品の寿司からも食中毒を引き起こすのに十分な新型SEsが検出された。次世代シーケンサーを用いて患者由来株の全ゲノム解析を実施した結果、エンテロトキシン遺伝子クラスター２周辺の遺伝子構造は、Sequence Type 45に属する菌に特異的であることが分かった。
2.食品取扱者手指、調理設備のふき取り検査を実施し、黄色ブドウ球菌の汚染調査および汚染に関与する衛生管理の要因について統計学的解析を行った。食品取扱者手指17.3%、調理設備7.1%から黄色ブドウ球菌が検出された。衛生手袋使用のルール・マニュアルの策定と調理施設の消毒の実施が有効な汚染対策として挙げられた。黄色ブドウ球菌の59.8%が何らかのSE/SEl遺伝子を保有しており、い食中毒発生リスクが示唆された。
3.工場で炊飯された米飯について、炊飯中の細菌汚染は少なかったが，35℃での保存試験に伴って生菌数が経時的に著しく増加した．黄色ブドウ球菌の接種試験により，経時的な菌の増殖とエンテロトキシン産生が確認された．pH調整剤の明確な静菌作用は認められなかった．期限内の米飯であっても取り扱いを誤れば，大規模な食中毒に発展する可能性があることが明らかになった．
4.新型エンテロトキシンを検出する逆受身ラテックス凝集反応法RPLA法構築のため、市販のポリクローナル抗体およびラテックスパーティクルを用いた予備実験を行った。複数のメーカーの抗体およびラテックスパーティクルを供試し、試薬濃度や反応条件を変化させて最適化を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「研究実績の概要」１．で述べた、新型エンテロトキシンによる食中毒事件の検証についての成果は、新規性が高く、本科研費研究の主目的にあたる。得られた成果を学術論文、学会発表、依頼講演および、大阪健康安全基盤研究所ＨＰ上で公表することができた。２．で述べた調理人手指、調理施設のブドウ球菌汚染についての成果は、行政に還元し、食中毒予防対策に役立てることができた。３．で述べた工場で炊飯された米飯の細菌汚染についても新規性の高いものであり、さらに消費者の食の安全に大きく寄与する成果である。これも得られた成果を学術論文、学会発表として公表することができた。４．で述べた新型エンテロトキシンを検出するＲＰＬＡ法の構築が計画よりも遅れている点が課題であるが、他の研究および成果報告については順調に進行してきた。よって、「おおむね順調に進展している」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

「研究実績の概要」１．においてエンテロトキシン産生を確認したサンドイッチELISA法は感度、特異性ともに高く、優れた方法であり、食中毒検査にも適している。一方、地方衛生研究所や保健所検査室で行政が実施する食中毒検査においては、複雑な手技や測定機器を必要としない逆受身ラテックス凝集反応法（RPLA法）がブドウ球菌エンテロトキシンの検出法として、現在、一般的に用いられている。
現在、市販されているのは従来型のＡ型～Ｅ型エンテロトキシン検出RPLA法のみであるため、本研究では、新たに新型エンテロトキシンを検出できるＲＰＬＡ法を構築する。昨年度までに試薬を購入して複数回の予備実験を行い、大まかな作製方法や条件検討の方向性は確立している。今年度は主に細部の条件検討を行い、感度、特異性を向上させる。また、方法が確立したのちに、食中毒事例由来菌株や食品残品を用いた検証実験を行う。

Causes of Carryover

昨年度は、「今後の研究の推進方策」の項で述べた新型エンテロトキシンを検出することができるＲＰＬＡ法に関する予備実験を行い、最適な条件を決定する予定であった。そのために試薬類（抗体、ラテックスパーティクルなど）を複数のメーカーから購入し、抗体濃度や反応バッファー等の試薬類についても複数の既報論文を参考に様々な組み合わせを用いて条件検討を行った。
その結果、ある程度、最適化の方針が決定したが、検査に使用できるほどの検出感度および特異性は得られなかった。また、試薬類はほとんどが海外で生産されるものであり、欠品や納期遅れなどがしばしば発生したことから、昨年度中に条件検討を終了させることができなかった。今年度は、決定した最適化の方針に従って、さらに検出感度や特異性を高める工夫を行う予定である。今年度の直接経費の主な使用計画は、試薬購入（抗体、バッファー類）と学会参加費、論文発表費である。