2020 Fiscal Year Research-status Report
デジタルPCRによるmtDNAのハプログループ分類と混合度の定量評価
| Project/Area Number |
19K19478
|
|---|
| Research Institution | Tohoku University |
|---|
Principal Investigator |
大内 司 東北大学, 医学系研究科, 技術一般職員 (90712266)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 混合試料 / ミトコンドリアDNA / ハプログループ / デジタルPCR |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では法医学で問題となる複数人のDNAが混ざった所謂「混合試料」に対する新たな解析法として、ミトコンドリアDNA（mtDNA）のハプログループを指標としたデジタルPCR（dPCR）による検査システムの構築を試みている。
日本人集団におけるmtDNAハプログループ頻度に基づき、18個の一塩基多型 (Single Nucleotide Polymorphism ; SNP)部位を標的と定め、前年度までに9か所のSNPに対してdPCRによる型判定が可能な反応系を構築した（G, D, D4*, D4a, D4b, D4e, D5, A, F)。本年度は残る9か所のSNP(M, M7, M8, M9, M10, N, N9, Y, B)に対して改めてプライマー及びプローブを設計し、再検討した。
前年度と同様に検査試料として野生型及び変異型の合成二本鎖DNAを混合せずに使用し、dPCR装置が使用できない期間もあったが、リアルタイムPCR装置を代用することで検討を重ね、結果として全18か所のSNPに対し、DNAが混在しない状況下でdPCRによる型判定が可能なプライマー及びプローブを設計することができた。加えて、18か所のSNPを同時に検査するためのPCR条件（アニーリング・エクステンション温度）を設定するためグラジエントPCRを行った結果、52℃が最適であることが確認された。
現在、上記二本鎖DNAを用いて実験的に混合試料を作製し、それぞれのSNPにおいて混合比率が正しく算出できるか検討を行っている段階である。最終的には本検査法をヒト血液由来のDNA溶液に適用し、mtDNAのハプログループ分類と混合比の算出が可能であるか検討する方針である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究で使用しているdPCR装置の部品が劣化したため修理が必要になったが、新型コロナウィルスの影響で修理の予定が延期になり、2020年3月から8月まで使用することができなかった。そのため当初の予定よりも遅れている状況である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
これまでにmtDNAのハプログループを規定する18か所のSNPに対してdPCRによる検査システムを構築し、DNAが混在しない状況下で野生型及び変異型コントロールをそれぞれ正しく型判定できることが確認できた。
現在、野生型及び変異型の合成二本鎖DNAを用いて実験的に混合試料を作製し、各SNPにおいてmtDNAの混合比が正しく算出できるか検討している段階である。
最終的にはヒト由来のDNAに適用し、mtDNAのハプログループ分類と混合比率の算出が可能か検討を行う方針である。
|
| Causes of Carryover |
新型コロナウィルスの影響によってdPCR装置の修理が遅れ、その間同装置を使用することができなかったことから研究の延長を余儀なくされた。
現在は修理され使用可能な状態であるため、残余金の大部分は同装置専用の試薬及び消耗品の購入に充てる予定である。
|
