2019 Fiscal Year Research-status Report

STR型検査におけるPCR副産物の発生量予測モデルの開発

Research Project

Project/Area Number	19K19492
Research Institution	National Research Institute of Police Science
Principal Investigator	深川貴志科学警察研究所, 法科学第一部, 研究員 (90801572)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	フラグメント解析 / スタター
Outline of Annual Research Achievements	STR(Short tandem repeat)型検査では、PCRによりSTR領域(アレル)を増幅して型判定解析を行うが、その際、スタターと呼ばれる、本来のアレルより1回繰返し回数が少ない副産物が生じる。スタターはPCRにおいてSlippageで生じるとされている。PCRでSlippageが発生する確率、つまりスタター発生率を測定し、スタター比率の予測を試みることが、本研究の目的である。スタターは繰返し回数・繰返し配列の種類・STR領域ではない部分の寄与等のDNA配列の様々な要素及び温度等のPCR条件の要素が複合的に作用していると考えられる。いきなりこれらの複合的な要素を扱うことは非常に難しいので、本研究では、スタター発生に関する要素が最も少ない単純なSTR領域である１種類の繰返し配列(とプライマー結合領域)からなる人工合成DNAを用いて実験を行った。2019年度は、本研究の骨幹である「スタター発生率の測定手法の確立」を試みた。主に、適切な鋳型DNAオリゴ量、PCRの条件、泳動条件などについて検証を行い、ジェネティックアナライザーで検出する際、適切な蛍光強度になるよう検討及び調整をした。その結果、スタター発生率の測定手法をほぼ確立することができた。しかし、人工合成DNAを用いるうえでの問題である不純DNAオリゴに関する問題も明らかになったため、人工合成DNAの精製度合いを高める必要があることも分かった。スタター発生率の測定手法の確立は初めてのことであり、学術的に大きな意義があるといえる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason まず、スタター比率を測定する系及びスタター発生率を測定する系の確立をするために、フラグメント解析の検出系の確立を試みた。主に、適切な鋳型DNAオリゴ量、PCRの条件、泳動条件などについて検証を行い、ジェネティックアナライザーで検出する際に適切な蛍光強度になるように最適化をした。その結果、スタター比率を測定する系においては、およそ70～80分子の鋳型DNAオリゴを29サイクルのPCRで増幅すれば、適切な蛍光強度になることが分かった。また、スタター発生率を測定する系においては、およそ1000億分子の鋳型DNAオリゴを、1サイクルのPCRで増幅すれば、適切な蛍光強度になることが分かった。この結果から、スタター比率及びスタター発生率を測定する系がほぼ確立できたといえる。しかしながら、今回注文したDNAオリゴは脱塩精製のみであったため、１～２塩基短い不純DNAオリゴが無視できないほど混じっていることも分かった。今回の場合、スタターは４塩基数ずれて生じるものなので、不純DNAオリゴと区別すること可能であるが、４塩基短い不純DNAオリゴが存在する場合、スタターなのか不純DNAオリゴなのか区別できなくなるため、何らかの対策が必要である。
Strategy for Future Research Activity	2020年度は、確立したスタター比率及びスタター発生率を測定する系を用いて、スタター発生率よりスタター比率の分布をシミュレーションし、これと実際のスタター比率の比較を行う。また、余裕があれば、この比較を様々な種類のDNAオリゴについて行う。なお、脱塩精製のDNAオリゴには不純DNAオリゴが無視できないほど混じっていることが2019年度に判明したため、今後は脱塩精製ではなく、より不純DNAオリゴを除去することが可能なPAGE精製をしたDNAオリゴを用いて実験を行うことにする。
Causes of Carryover	2019年度の計画である検出系の確立に用いるDNAオリゴについて、当初想定していた必要量よりも少なくても問題ないことが判明したため、次年度使用額が生じた。2020年度は、様々な種類のDNAオリゴについてデータを取得する予定だが、その種類の数を次年度使用額を用いて増やしたいと考えている。