2019 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of molecular mechanisms involved in the pathogenesis of muscular contracture and development of physical therapeutic strategies
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19K19795
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
本田 祐一郎 長崎大学, 病院(医学系), 技術職員 (40736344)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 筋性拘縮 / ミトコンドリア / アポトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は「筋性拘縮の発生機序におけるミトコンドリアの恒常性の変化の影響」を主目的として掲げ，不動化した骨格筋におけるミトコンドリアDNAの変化を検索し，これまでの自験例と照合することで筋性拘縮の発生機序におけるミトコンドリアの恒常性の変化を検討した．実験動物には8週齢のwistar系雄性ラット10匹を用い，両側足関節を最大底屈位にてギプスで7日間不動化する不動群（各5匹）と同週齢まで通常飼育する対照群（各5匹）に振り分け，実験期間終了後は各ラットの両側ヒラメ筋を採取した．そして，採取した筋試料の一部をアポトーシス関連分子である活性型caspase-3の定量のためにwestern blot法に供した結果，不動群の活性型caspase-3発現量が対照群よりも有意に高値を示した．つまり，自験例と併せて考えると，不動に伴う活性型caspase-3の発現亢進は筋核のアポトーシスに関与しており，この変化が筋性拘縮の発生メカニズムに寄与していると推察された．一方，筋試料の一部はミトコンドリアの恒常性を評価するためにNADH-TR染色のプロトコル作製に供し，これまでにその染色プロトコルが確立された．そのため，今後は筋試料のNADH-TR染色像を用いて筋線維100本あたりの虫食い様線維やセントラルコア様線維の出現率を計測する予定である．また，一部の筋試料は分子生物学的検索に供し，ミトコンドリアDNAの定量プロトコルの作製を行った．その結果，ラットヒラメ筋からミトコンドリアDNAを抽出するプロトコルが確立され，各筋試料から安定した収量を確保することが可能となった．今後は抽出されたミトコンドリアDNAを使用し，ミトコンドリア融合因子のmitofusin proteins（Mfn）や分裂因子のDrp1の発現量を検索していく予定である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は「筋性拘縮の発生機序におけるミトコンドリアの恒常性の変化の影響」という研究目的を基盤に計画を進めてきた．その結果，筋性拘縮の発生メカニズムの重要事象である筋核のアポトーシスに活性型caspase-3の発現亢進が関与することが明らかとなった．しかし，筋試料に対するNADH-TR染色のプロトコルやミトコンドリアDNAの抽出プロトコルの作製に時間を要したため，組織学的検索や分子生物学的検索がやや遅延している状態にある．
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究成果から，ミトコンドリアの恒常性を評価する組織学的検索ならびに分子生物学的検索のプロトコルが確立された．そこで，次年度は本年度の筋試料の一部から作製した凍結横断切片にNADH-TR染色を施し，筋線維100本あたりの虫食い様線維やセントラルコア様線維の出現率を計測する．さらに，本年度の筋試料の一部は生化学的検索および分子生物学的検索に供し，アポトーシス関連分子であるるcaspase-8，9ならびにミトコンドリアの恒常性に関与するMfnやDrp1，Bid/tBid，cytochrome-cの発現状況を検索する．そして，これらの成果と本年度の成果を統合し，筋性拘縮の発生に関わる分子機構の解明を目指す．
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