2020 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of the mechanisms underlying chronic neuropathic pain using tibial nerve injury model mice and the effect of exercise therapy
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19K19871
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
小坂 祥範 琉球大学, 医学研究科, 客員研究員 (10835242)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 神経障害性疼痛 / 疼痛行動検査 / ミクログリア / 自走式回転式運動具 / GABA / K+, Cl- 共輸送体（KCC2) / 脊髄後角 / 脛骨神経 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
坐骨神経痛をはじめとする神経障害性疼痛は、世界規模の健康問題である。近年の研究により、発症原因の１つとして、γ-アミノ酪酸(GABA)の機能異常が注目されている。しかしながら、そのメカニズムに関して不明の点が多い。本研究は、慢性疼痛モデルマウスを用いてGABA伝達に関与するシグナル分子の動きを解析し、GABA伝達の異常を介する神経障害性疼痛の発症メカニズムを明らかにすることを第１の目的としている。加えて 同じモデルマウスに運動療法を加えることにより、GABAの機能異常および疼痛が改善されるか明らかにすることを第２の目的として研究を行っている。
2019年度では、慢性疼痛のモデルマウスの作製から行った。坐骨神経の１枝である脛骨神経を結紮した場合と切断した場合の2種類のモデルを作製した。このモデルマウスを材料として、疼痛行動評価、組織学的変化、腰髄後角におけるGABA伝達に関連する分子の発現変化、さらに、GABAの作用に影響を与えるミクログリアの変化を解析した。その結果、切断モデルでは疼痛閾値の低下は生じるが2か月を超えると回復した。一方結紮モデルでは3か月以上にわたって痛みが持続していた。このことから、脛骨神経結紮モデルが慢性疼痛のモデルであることが明らかになった。この両モデルの共通点と相違点を解析した結果①神経の変性、②ミクログリアの分裂・活性化、③KCC2の発現低下、③GABAの抑制機能の低下、④痛覚過敏が発症、という流れで慢性疼痛が発症することが明確になった。この成果は、Brain Research誌に掲載された。
2020年度は、適切な運動負荷をかけることにより、モデルマウスにおける疼痛閾値が改善するか解析した。その結果、運動療法を加えない場合には3か月以上疼痛が持続したが、運動療法を加えた群では、2か月以降で有意に回復し、3か月目には正常化することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
コロナ禍にあり、2020年度の前半は琉球大学内リモートワークが中心となり、動物実験施設への出入りが大幅に制限された。その結果、動物実験を十分に遂行することができず、1年間、研究期間を延長した。現在、運動療法を行った動物の行動解析と組織採取（脊髄、坐骨神経など）は終了している。2021年度その組織の解析を行うことにより研究は終了することができる。
2019年度の研究の結果、慢性疼痛モデルマウスでは、脊髄後角において次の事を明らかにした。（１）ミクログリアの増殖と活性化、（２）二次知覚ニューロンでのKCC2発現量の減少、（３）（１）と（２）が慢性疼痛を生じる領域で3か月以上にわたって継続する。この結果は、Brain Research誌（2020年）に掲載された。
2021年度は、慢性疼痛モデルを作製し、自走式回転式運動具を用いて運動療法を行った群と従来型のケージ飼育を行った群で比較検討した。2019年度と同様、von Frey法で行った。その結果、（１）手術前後で、マウスの運動量に変化はなく、運動機能に大きな障害はなかった。（２）運動療法を行わないコントロールでは90日後も疼痛閾値が極めて低いままであった。（３）運動療法を行ったマウスでは、術後56日目以降顕著に回復し、疼痛閾値は健常側と有意差が無いレベルに回復した。加えて、術後各ステップの脊髄と坐骨神経・脛骨神経を採取終了している。
組織変化は解析途中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は以下の点に重点をおいて解析を行い、運動療法群とコントロール群で比較することにより、運動療法による疼痛軽減メカニズムを明らかにする予定である。
１．脛骨神経における組織変化 脛骨神経をゆるく結紮することにより、腓腹神経の支配領域（足底部外側）において疼痛（疼痛閾値の著しい低下）が現れる。神経束内においては、神経が2週間かけてすべての軸索がワーラー変性し、3週目より無髄線維の再生が開始され、有髄化の後、8週頃にもとの密度に回復する。この変性・再生過程が運動療法によってどのように変化するか（促進されるか、変化しないかなど）を電子顕微鏡を用いて解析する。
２．脊髄後角における変化 神経が変性すると、脊髄後角において、ミクログリアが分裂増殖、活性化され、二次知覚ニューロンでのKCC2の発現が低下する。KCC2が低下することにより、GABAによる抑制力が低下し、結果として閾値が低下する。さらに、変性が起こっている間は、前角においてガラニンが強く発現する。また、これまでの研究で、GABA入力が減少するとの報告もある。以上の結果をもとにして、運動療法において、シグナルが変化するかを解析する。
シグナル分子の発現解析のポイント①ミクログリアの活性化（Iba1の免疫組織化学）、②変性・再生過程の解析（galaninの免疫組織化学）、③GABAの抑制性（KCC2：GABA作用の抑制性/興奮性の決定の免疫組織化学、④GABA終末の密度（グルタミン酸脱炭酸酵素：GAD、小胞型GABA輸送体：VGATの免疫組織化学）
以上の結果を疼痛閾値の回復との関係で解析し、運動療法が慢性疼痛の発生のどの過程で効果を表しているかを明らかにする予定である。
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| Causes of Carryover |
2020年度は、コロナ禍で、動物施設の利用が強く制限された。そのため、前半部において動物実験を十分に行うことができず、モデル動物、行動解析、脊髄・坐骨神経などの試料の採取が遅れ、予定していた研究をすべて遂行することはできなかった。そのため、1年間延長し、組織変化の解析のための費用が必要になった。また、追加の動物実験が必要になる可能性がある。具体的には、免疫組織化学のための、抗体購入、染色キット、動物購入費用、飼育費用などである。
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Research Products
(2 results)
