2019 Fiscal Year Research-status Report
摂食障害に着目したエピジェネティクス制御とGPCRの相関関係
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19K20143
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
濱本 明恵 岐阜大学, 工学部, 助教 (60784197)
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2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Gタンパク質共役型受容体 / メラニン凝集ホルモン / 摂食 / ヒストン脱アセチル化酵素 / エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
最近、エピジェネティクスと摂食障害の関係が注目されている。エピジェネティクスとはDNA塩基配列の変化を伴わない、後天的な遺伝子の修飾機構（DNAメチル化、ヒストンアセチル化など）のことである。特にヒストンがアセチル化された領域ではDNAの巻き付きが緩むために転写が亢進されるが、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）により脱アセチル化されると転写が抑制される。これまで一部のGタンパク質共役型受容体（GPCR）とHDACが相互作用すると報告されているが、摂食関連GPCRとHDACの関係については全く不明であった。そこで本研究では摂食亢進GPCRとしてメラニン凝集ホルモン受容体（MCHR1）に着目し、HDACとの相関関係を網羅的に解析した。
まず、阻害剤であるトリコスタチンA処理によりMCHR1を介した細胞内シグナル系やMCHR1のタンパク質発現量が変化したことからMCHR1がHDACと相関関係を有していることを見出した。次に、HDACクラスⅠとⅡ（HDAC1～10）の内、どのHDACサブタイプが特に重要な役割を担っているかを検討した。その結果、細胞内シグナル系の解析（レポーターアッセイ）、ウエスタンブロット法、細胞免疫染色、定量PCR法などから、特にHDAC5、9、10がMCHR1との相関関係に重要であることが判明した。一方、細胞内シグナルの上流ではHDAC阻害剤処理やHDACを強制発現しても差が見られなかった。従って、HDACはMCHR1を介した細胞内シグナル経路内の下流で関与しており、長期的にMCH-MCHR1系を制御している可能性が考えられる。今後さらに詳細な分子機構を解明することでHDACと摂食関連受容体との関係が解明され、摂食障害や肥満の新たな治療戦略となることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
従来予定していたHDACとMCHR1の相関関係の有無の解析と、それに関与するHDACサブタイプの特定を行うことが出来た。
具体的には、HDAC阻害剤であるトリコスタチンA（TSA）処理により、細胞内シグナルの下流であるNFAT転写活性やMCHR1受容体発現量が変化したことからMCHR1とHDACには相関関係があることが分かった。次に、HDACクラスⅠ、Ⅱの内、どのサブタイプが特に重要かを明らかにするため、各HDACとFlag-MCHR1を共発現させたところ、MCH添加によりHDAC3, 5, 9, 10のタンパク質発現量が増加した。また、Flag-MCHR1が安定発現したHEK293T細胞にHDAC3, 5, 9, 10を過剰発現させることで、MCH添加によるNFAT転写活性が亢進した。次に、MCH添加によるHDACとMCHR1の局在の変化を細胞免疫染色法で調べたところ、通常MCHR1はMCH添加により細胞膜上における発現が低下する（受容体インターナリゼーション）が、HDAC5, 9, 10を共発現させることでMCH添加による膜発現低下が抑制された。さらに、定量PCR法を行った結果、MCH刺激により内在性HDAC5, 9, 10のmRNA発現量が変化することを確認した。一方、細胞内シグナルの上流である細胞内カルシウムイオン流入やERK1/2リン酸化ではHDAC阻害剤処理やHDACを強制発現しても差が見られなかった。従って、HDACはMCHR1-Ca-NFATシグナル経路内の下流で関与しており、長期的にMCH-MCHR1系を制御している可能性が考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はin vivoにおいて、摂食関連GPCRとHDACの相関を解析するために、マウスの脳室内または腹腔内に摂食関連GPCRのアゴニストやアンタゴニスト、HDAC阻害剤を投与する。その後、各GPCRやHDACの発現変化を調べる。また摂食行動や鬱をはじめとした表現型も評価する。また、脳室内または腹腔内へ、摂食関連GPCRのリガンドまたはHDAC阻害剤を投与する。対象は、野生型マウスおよびSIK3-KOマウスとし、エピジェネティクス制御をアセチル化抗体を用いたクロマチン免疫沈降法と次世代シーケンサーで解析する。さらに、HDACと直接相互作用するGPCRまたはGPCR調節タンパク質（Gタンパク質キナーゼ、RGSタンパク質など）を同定するために、マウス組織を用いてHDACの免疫沈降を行い、各HDACに結合するタンパク質をMS-MS解析により特定する。
＜塩誘導性キナーゼSIK3KOマウスにおける摂食関連GPCRの活性制御＞
SIK3-KOマウスは低体重、無食欲症様の表現型を示し、HDAC4の発現低下が報告されている。そこで、SIK3-KOマウスにおいて摂食関連GPCRやその他HDACの発現機能に変化が生じているかを調べ、無食欲症をレスキュー出来るかを検討する。
①SIK3-KOマウスにおいて、HDACの各発現や活性がどのように変化しているかを調べる。各組織のヒストンアセチル化活性を測定する。②SIK3-KOマウスにおける摂食関連GPCRの受容体発現量を調べる。③②で発現変化が認められたGPCRのアゴニストやアンタゴニストをSIK3-KOマウスに投与することで、摂食が亢進するかを解析する。
本研究により、摂食関連GPCRとHDACの相関関係が明らかになり、摂食行動および摂食障害における新規メカニズムが明らかになることが期待される。
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[Journal Article] Azepine derivative T4FAT, a new copper chelator, inhibits tyrosinase.2019
Author(s)
Okajima S, Hamamoto A, Asano M, Isogawa K, Ito H, Kato S, Hirata Y, Furuta K, Takemori H.
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Journal Title
Biochem Biophys Res Commun.
Volume: 509
Pages: 209-215
DOI
Peer Reviewed
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