2019 Fiscal Year Research-status Report
アロステリック人工酸素運搬体（ヘモグロビン-アルブミン）トリマーの創製
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19K20699
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
森田 能次 中央大学, 理工学部, 助教 (40795308)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / ヘモグロビン / 人工酸素運搬体 / アロステリック効果 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
赤血球の代替物としての「人工酸素運搬体」の実現は、次世代医療の最重要課題である。これまで多くの修飾ヘモグロビン製剤が開発されたが、酸素結合に見られるアロステリック効果（協同性）が減少してしまう欠点があった。本研究は、赤血球の酸素運搬能を完全に維持したアロステリック人工酸素運搬体（ヘモグロビン-アルブミン）トリマーの創製を目的とする。具体的には、協同性に影響しないヘモグロビン（Hb）表面のアミノ酸残基を架橋点としてアルブミン（HSA）を結合する。Hb本来の協同性が完璧に維持された人工酸素運搬体を合成するとともに、その構造解析、酸素放出能制御、血中滞留性評価を行う。
１）ピキア酵母を宿主とする組換え変異ヘモグロビン（rHb）の産生：部位特異的アミノ酸置換法を用いて、四次構造変化に関与しないアミノ酸残基をCysに置換したrHb発現ベクターを調製した。ピキア酵母(GS115)を形質転換し、rHb発現ピキア酵母を得た。培養後、菌体を破砕し、イオン交換クロマトグラフィーによりrHbを精製した。
２）（ヘモグロビン-アルブミン）トリマー［rHb-HSA2］の合成：ヒト血清アルブミン（HSA）とrHbを連結するため、ビスマレイミド架橋剤を用いてrHb-HSA2を合成した。陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーを利用する調製方法を確立した。得られたrHb-HSA2はヒトHbと同等の酸素親和性、協同性を示すことが明らかとなった。
３）化学修飾による酸素親和性制御：脱酸素条件でHbにリシン修飾剤を反応させると酸素親和性が低下する。脱酸素条件での合成とカラム精製が鍵となるため、グローボックスを購入し、rHb-HSA2への化学修飾条件・カラム精製方法を確立した。得られた化学修飾rHb-HSA2は低酸素親和性を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画に従い実験を遂行し、2019年度の目標であった「rHb-HSA2の合成」、「酸素放出能と構造の解析」を達成することができた。化学修飾による酸素放出能の制御は、反応条件の探索、精製方法の検討に時間を要したが、最近ようやく反応率が向上し、目的物を単離することができるようになった。また、化学修飾による酸素親和性の制御についても着手しており、修飾率により酸素親和性が調節できることも明らかになっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、「部位特異的アミノ酸置換による酸素親和性制御」を行う。赤血球と同等の酸素親和性、協同性を有する人工酸素運搬体を合成するため、協同性を維持したまま酸素親和性が低い変異rHb［rHb(X)］を調製し、rHb(X)-HSA2を合成する。既に、部位特異的アミノ酸置換により変異させたrHb(X)の合成を始めており、期限内に目標とする実験が終了する目途は立っている。
2年間で、赤血球と遜色のない人工酸素運搬体の基礎化学を確立する。
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| Causes of Carryover |
上記の通り、本研究計画は概ね順調に進んでおり、当初計上していた培地、試薬、ガラス器具、クロマトカラム用ゲルなどの消耗品の消費量が思ったより少なくて済んだ。また、rHb(X)の合成を2019年度より始めているが、考えていた三重変異体を作らなくとも、酸素親和性の調節が十分にできそうであることもわかってきた。以上の理由により、2019年度は計上額との間に差額が生じた。
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