2017 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanisms of Cdc42-dependent salivary acinar formation.
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17H07212
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Asahi University |
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Principal Investigator |
設楽 彰子 朝日大学, 歯学部, 助教 (30508718)
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| Project Period (FY) |
2017-08-25 – 2021-03-31
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| Keywords | Cdc42 / 上皮 / 極性 / 唾液腺 / 管腔 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではRho GTPaseの一種であり上皮細胞極性形成の中心として働くCdc42のコンディショナルノックアウト(CKO)マウスを用いて、腺房細胞の形態形成を制御するCdc42依存性のシグナル経路の解析を行った。
私はまず、Cdc42 floxマウス、唾液腺腺房細胞に特異的にCreリコンビナーゼを発現するアクアポリン5-Cre(AQP5-Cre)マウスを研究協力者である米国国立癌研究所のRoberto Weigert博士より入手し、Cdc42 CKOマウスを作成した。
次に、野生型マウスとCdc42のCKOマウスの腺房細胞の発生過程における形態変化を解析した。その結果、野生型マウスにおいて細胞間小管と呼ばれる腺房細胞に特徴的な管腔構造の形成が生後５日に起こることがわかった。一方Cdc42 CKOマウスにおいては、生後５日において細胞間小管の形成は観察されず、Adultのマウスにおいても形成みられなかった。これらの結果から、Cdc42は唾液線腺房細胞において管腔構造の形成を制御することが明らかになった。
次に私は免疫染色により、Cdc42が細胞間小管を形成するメカニズムの解析を行った。野生型マウス、Cdc42 CKOマウスを腺腔側膜のマーカータンパク質であるAQP5に対する抗体で免疫染色したところ、生後５日のCdc42 CKOマウスの腺房細胞において、腺腔側だけでなく細胞内小胞上にもAQP5が観察された。一方、基底側膜のマーカータンパク質、Cdc42のエフェクターの一つであり、極性タンパク質として知られるPar6の局在に変化は見られなかった。これらのことから、Cdc42は腺房細胞において、腺腔側膜の極性輸送を制御することにより、細胞間小管の形成を促進することが示唆された。
これらの成果を第４０回日本分子生物学会にて発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実験に用いるノックアウトマウスの使用、飼育について朝日大学において「 組み替えDNA実験安全委員会（承認番号：17-001） 」および「 動物実験委員会 （承認番号：17-046）」の審査・承認を受けたのち、米国国立癌研究所のRoberto Weigert博士よりマウスを入手した。さらにこれらのマウスを朝日大学実験動物飼育施設内において掛け合わせ、当初の計画通り、Cdc42の腺房細胞特異的なコンディショナルノックアウトマウスの作成を完了した。さらに本マウスを用いて腺房細胞の経時的な形態変化を共焦点レーザー顕微鏡にて調べた。取得した画像の解析は、名古屋大学ライブーメージングセンター（ITbM）の佐藤良勝博士の協力の元、画像解析ソフトImarisを用いて順調に進展している。本解析から、腺房細胞の管腔・細胞間小管の形成が生後５日に観察されること、およびその形成がCdc42依存性であるとの新たな知見を得ることができた。さらに免疫染色よりCdc42のコンディショナルノックアウト細胞において、細胞内輸送が変化していることが示されたことから、Cdc42依存性の管腔形成の分子メカニズム解明へと発展する結果を得ることができた。これらの研究成果を当初の計画通り第４０回日本分子生物学会（2017/12/6-9; 神戸ポートアイランド）にて発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ここまでの研究から、１）腺房細胞の管腔・細胞間小管の形成が生後５日に観察されること、２）その形成がCdc42依存性であること、３）Cdc42は細胞内輸送を制御することにより細胞間小管の形成を促進することが示唆された。
MDCK細胞による三次元培養系や、マウス小腸組織をモデルとした解析から、上皮細胞の腺腔側膜の形成には、Rab11aを持つ細胞内小胞が重要な役割を果たすことが示されてる。興味深いことにCdc42およびCdc42により活性化され、細胞極性形成に重要な役割を果たすPar複合体はRab11a小胞の輸送を制御すると考えられている。そこで今後は免疫染色およびウェスタンブロッティングを中心とした生化学的解析によりRab11a小胞の輸送に関わると言われている、Rab11a, Rab8, Myosin5,Par6, aPKCなどの局在、発現量、リン酸化などの活性化を調べる。これらの解析から腺房細胞におけるCdc42依存性の管腔形成の分子メカニズムを明らかにし、第61回歯科基礎医学会、第42回日本分子生物学会年会、もしくはGordon Research Conference；Salivary Glands & Exocrine Biologyにて発表する予定である。
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