DNAフリーゲノム編集柑橘作出ための基盤技術開発

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H06010
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 賀屋 秀隆 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (80398825)
• Project Period (FY): 2018-08-24 – 2020-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / カンキツ / DNAフリー

Outline of Annual Research Achievements

愛媛県の最重要作物である柑橘類において，DNA を用いないゲノム編集（DNA フリー・ゲノム編集）技術の確立を目指す．この目的のために，パーティクルボンバードメント法により，ゲノム編集酵素複合体 (Ribonucleoprotein: RNP) をカンキツ細胞に直接導入する．この方法により作出したゲノム編集カンキツは，遺伝子組み換え生物の規制の対象外になると考えられる．よって，この技術は，カンキツの革新的な育種技術となると期待される．
1)シロイヌナズナ内在遺伝子を標的としたDNAフリーゲノム編集の試み．カンキツ細胞に先立ち，遺伝解析が容易で，多彩な突然変異体が利用可能なシロイヌナズナを用いて，パーティクルボンバードメントによりRNPを直接導入するDNAフリーゲノム編集を試みている．これまでのところ，ゲノム編集個体の候補を得ている．今後，ゲノム編集されているかどうかを検証する．ゲノム編集個体であることが確認できれば，off-target変異の程度を調べると共に，パーティクルボンバードメント条件の最適化もおこなう．
2）カンキツ細胞への直接導入の試み．これまでに，カンキツの一つであるカラタチの胚軸からカルスを誘導し，さらにこのカルスから高効率で個体を再生させる条件が明らかになりつつある．そこで，カラタチのカルスにパーティクルボンバードメントによりRNPの導入実験をはじめる．まずは，パーティクルボンバードメントによりRNPと共にGFP遺伝子を導入し，GFPの蛍光観察により導入効率を調べることで，パーティクルボンバードメント条件の条件検討をおこなう．並行して，ゲノム編集されたカルスを探索する．ゲノム編集カルスを得られた場合は，カルスから個体の再生をおこなう．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1）シロイヌナズナ内在遺伝子を標的としたDNAフリーゲノム編集の試み．これまでにゲノム編集個体の候補を得ている．今後，ゲノム編集ができているかどうかを，検証する．

2）カンキツ細胞へのRNPの直接導入の試み．これまでに，カラタチの胚軸からのカルス誘導条件，さらにカルスからの個体再生の条件が明らかになりつつある．今後は，シロイヌナズナでのパーティクルボンバードメントの条件を基に，カルスへのRNP導入を試みる．

Strategy for Future Research Activity

1）シロイヌナズナ内在遺伝子を標的としたDNAフリーゲノム編集の試み．まずは，ゲノム編集ができていることを確認する．もし確認できれば，off-target変異を調べると共に，複数の標的遺伝子についても，ゲノム編集できるかどうかを調べる．

2）カンキツ細胞へのRNPの直接導入の試み．シロイヌナズナでのパーティクルボンバードメントの条件を基に，カラタチ由来のカルスへのRNP導入を試みる．パーティクルボンバードメントによりRNPと共にGFP遺伝子を導入し，GFPの蛍光観察により導入効率を調べることで，パーティクルボンバードメント条件の条件検討をおこなう．並行して，ゲノム編集されたカルスを探索する．ゲノム編集カルスを得られた場合は，カルスから個体の再生をおこなう．