2018 Fiscal Year Annual Research Report
上皮性付着に関与するアメロチンに焦点をあてた歯周病発症メカニズムの解明
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18H06297
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
高井 瑞穂 (山崎瑞穂) 日本大学, 松戸歯学部, 助手(専任扱) (20822620)
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| Project Period (FY) |
2018-08-24 – 2020-03-31
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| Keywords | AMTN / miR-200b / 接合上皮 / TNF-α / 歯肉上皮細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト歯肉上皮細胞Ca9-22をTNF-αで12時間刺激すると、AMTN mRNA量は増加した。miR-200b発現プラスミドを導入するとTNF-αによるAMTN mRNA量の増加は抑制された。Ca9-22細胞にmiR-200b inhibitorを導入しTNF-αで刺激するとAMTN mRNA量はさらに増加した。-353塩基上流から+60までのヒトAMTNプロモーター領域を含むルシフェラーゼプラスミドにAMTN 3’-UTRを挿入し、コンストラクトを作製した。これをCa9-22細胞に導入し、TNF-αで12時間刺激するとルシフェラーゼ活性が上昇したが、miR-200b発現プラスミドを導入するとTNF-α刺激による活性上昇は部分的に抑制された。TargetScan7.1を用いてmiR-200bの標的遺伝子予測を行った結果、TNF-α刺激により活性化されるNF-κB経路中の因子であるIKKβの3’-UTR中にmiR-200b結合配列があることが予測された。Ca9-22細胞をTNF-αで刺激するとIKKβ mRNA量は増加し、miR-200b発現プラスミドを導入すると減少した。Ca9-22細胞をTNF-αで刺激するとAMTNタンパク量は12時間後に増加した。IKKβタンパク量は6時間後に最大となった。Ca9-22細胞をTNF-αで刺激すると、AMTNタンパク量は増加した。IKKβタンパク量は、miR-200b発現プラスミドを導入すると無刺激時、刺激時ともに減少した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト歯肉上皮細胞Ca9-22をTNF-αで刺激すると、AMTNおよびmiR-200b発現量が増加することが明らかになった。ヒトAMTN 3'-UTRを含むルシフェラーゼコンストラクトの作製に成功し、ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼ活性はTNF-α刺激により増加し、miR-200bの過剰発現により抑制されることが確認できた。miR-200bの標的遺伝子を検索し、TNF-αにより活性化されるNF-κB経路中のIKKβのmRNA量およびタンパク量がmiR-200b過剰発現により抑制されることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
miR-200b発現プラスミドを導入したCa9-22細胞をTNF-αで刺激し、AMTN抗体を用いて免疫蛍光染色を行い、細胞内でのAMTNタンパクの局在の変化を解析する。Ca9-22細胞にNF-κBおよびIKKβ阻害剤を作用させ、全RNAおよびタンパクを抽出し、定量PCRまたはウェスタンブロットにて解析し、TNF-αによるAMTN遺伝子発現とNF-κB経路の関連性を検証する。
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