Elucidation of bone marrow niche signal by epigenome analysis and establishment of marrow reconstitution culture method

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H06300
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Tsurumi University
• Principal Investigator: 金澤 三四朗 鶴見大学, 歯学部, 助教 (60823466)
• Project Period (FY): 2018-08-24 – 2020-03-31
• Keywords: single cell RNA-seq / open chromatin analysis / 幹細胞ニッシ

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、ES、iPS細胞の核内ゲノム構造を指標にして、骨髄MSPCのゲノム構造変化との比較により、MSPC特性制御に関わるゲノム領域およびシグナルの特定と、このシグナルを活用した高機能化MSPCのin vitro増殖培養法を確立し、骨再生医療への展開を目指すことである。そのため、以下の研究を平成30年度に実施した。
1）マウス骨髄中に存在するniche構成間葉系細胞集団の特定。
2）特定間葉系細胞集団の分離マーカーの同定と遺伝学的特性解析。
具体的には、1）は現在Sca-1, PDGFR-α陽性で分画される細胞をMSCとされているが、実際はヘテロな細胞集団であることが示唆されている。研究代表者は、MSCをsingle cellレベルでの解析により、間葉系細胞集団（Mesenchymal Cell Population, MCP）の分離を試みた。MSCをsingle cell RNA-Seqにてクラスタ解析をおこない、遺伝子発現プロファイルから特異性のある7つ細胞集団が存在することを確認した。また、2）項は1)項で同定した各集団における上記網羅的遺伝子発現解析から、2倍以上発現増減した遺伝子を選定し、集団特異的マーカーを同定するため、得られたいくつかのマーカーの組み合わせから、FACSにて集団を分離可能か検討し、分離した細胞に対して、コロニー形成能試験、3系統分化能評価をおこなった。これらの結果から、最終的に同定した分離マーカーの有用性を確認した。
次に、分離した各細胞集団の細胞を網羅的かつ定量的に解析し遺伝子発現量を定量化し、細胞集団が遺伝学的にどのような特徴を有しているのか検討をおこなった。これらの細胞からmRNAを抽出し、RNA-Seqで解析をおこない、7つの細胞集団が、遺伝的にそれぞれ特異的な性質を有することを確認した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

MSCのsingle cell RNA-seqから、7つの異なる細胞集団が存在することが明らかになり、さらに分離マーカー検索に際して、検討に値した候補が少数であったことから、集団の分離マーカーおよび同定が予想以上に早く終了したと考える。また、分離した各細胞集団を用いたRNA-seq解析においても、single cell RNA-seqと同様の遺伝子発現変動を認めたため、効率的に作業を遂行することができたためと考える。

Strategy for Future Research Activity

本年度に引き続き、各細胞集団の遺伝学的特性をRNA-seqによって詳細に解析していき、解析結果を基にopen chromatin解析をおこない、epigeneticsに幹細胞特性を有する細胞集団を同定する。