2019 Fiscal Year Research-status Report
原始環境に存在したと推定されるアミノ酸のみで発現可能なタンパク質機能の探索
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19K21903
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
赤沼 哲史 早稲田大学, 人間科学学術院, 准教授 (10321720)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 生命の起源 / タンパク質の起源 / RNA結合 / ATP結合 / 鉄硫黄クラスター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞の「エネルギーの通貨」とも呼ばれるATPは、地球上のすべての生物が細胞内のエネルギーの保存や利用に用いる生体関連分子である。さらに、ATPはRNAワールドの主要な生体分子であるRNAの前駆体の一つでもある。したがって、ATPとの結合は原始タンパク質が必要とした機能の一つである可能性がある。祖先型ヌクレオシド二リン酸キナーゼであるArc1あるいは少数種アミノ酸で再構成されたArc1改変体のATP結合活性を、ATPアガロースを用いて検証した。その結果、Arc１と13アミノ酸種で再構成されたArc1-13FIではATP結合活性が見られた。さらに、Arc1-13FIからアルギニンまたはアスパラギンを欠損させた改変体ではATP結合活性が見られなかったが、Arc1-13FIからヒスチジンまたはチロシンを欠損させた改変体はATPと結合することが明らかになった。
鉄と硫黄は生命の起源に深く関わったと考えられている。フェレドキシンは内部に鉄－硫黄クラスターを持ち、原始的なタンパク質の一つである可能性が高い。フェレドキシンの進化系統解析と祖先配列解析から推定された祖先配列のアミノ酸組成を、様々な証拠から初期地球に比較的豊富に存在したと推定されているプレバイオティックアミノ酸と比較した。その結果、アーキア共通祖先フェレドキシンでは非プレバイオティックアミノ酸のうちの７アミノ酸種が欠損しており、バクテリア共通祖先フェレドキシンでは、非プレバイオティックアミノ酸のうちの６アミノ酸種が欠損していた。また、現存の真正細菌のフェレドキシンと比べて、アーキア共通祖先フェレドキシン、バクテリア共通祖先フェレドキシンともプレバイオティックアミノ酸が占める割合が増加していた。この結果は、プレバイオティックアミノ酸が原始タンパク質において多く使われていたことを支持する新たな証拠と言える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、原始タンパク質が担った機能として、ATP結合、鉄－硫黄クラスター形成およびRNAとの結合を仮定し、これらの機能が原始環境に存在したと推定される少数アミノ酸種から発現可能か検討することを目的としている。
令和元年度には、12アミノ酸種類で再構成した改変型タンパク質がATP結合能を保持できることを明らかにした。この成果に基づき、次年度以降に11種類あるいはさらに少ない種類のアミノ酸で再構成したタンパク質のATP結合活性を評価することによって、ATP結合活性を持つタンパク質の再構成に必要な最少アミノ酸種類数を検討することが可能となった。
鉄－硫黄クラスターを形成するフェレドキシンの再構成に関しては、アーキア共通祖先フェレドキシンとバクテリア共通祖先フェレドキシンがそれぞれ13種類あるいは14種類のアミノ酸だけから構成された。次年度以降には、共通祖先型フェレドキシンの大量発現、精製および物性解析をおこなうとともに、共通祖先型フェレドキシンをさらに少数種類のアミノ酸から再構成することによって、鉄－硫黄クラスターを形成するフェレドキシンの再構成に必要な最少アミノ酸種類数を検討することが可能となった。
RNA結合タンパク質の再構成に関しては、これまでにリボソームタンパク質S7とS8の進化系統解析および共通祖先型の再構成をおこなった。これにより、次年度以降に共通祖先型S7とS8から1種類のアミノ酸をすべて他のアミノ酸に置換した改変体を構築することによって、RNA結合能を維持したまま容易に欠損な可能なアミノ酸と欠損が難しいアミノ酸の探索に取り組むことが可能となった。
以上から、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ATP結合活性を持つタンパク質の再構成に必要な最少アミノ酸種類数を検討に関しては、ATP結合活性を保持した12種類のアミノ酸から再構成した祖先型ヌクレオシド二リン酸キナーゼ改変体から、さらに1種類のアミノ酸の欠損を検討することによって、11種類のアミノ酸からATP結合活性を持つタンパク質の再構成が可能か検討する予定である。11種類のアミノ酸からATP結合活性を持つタンパク質が再構成できれば、さらにもう1種類のアミノ酸を欠損させることによって、10種類のアミノ酸からATP結合活性を持つタンパク質の再構成が可能か検討する。このように、アミノ酸種類数を１つずつ減らしながら再構成したタンパク質のATP結合活性を評価することによって、ATP結合活性を持つタンパク質の再構成に必要な最少アミノ酸種類数を明らかにする予定である。
鉄－硫黄クラスターを形成するフェレドキシンの再構成に関しては、復元した共通祖先型フェレドキシンの大量発現、精製および物性解析をおこなう。次いで、共通祖先型フェレドキシンをさらに少数種類のアミノ酸から再構成することによって、鉄－硫黄クラスターを形成するフェレドキシンの再構成に必要な最少アミノ酸種類数を検討する。
RNA結合タンパク質の再構成に関しては、共通祖先型リボソームタンパク質S7とS8から1種類のアミノ酸をすべて他のアミノ酸に置換した改変体を構築することによって、RNA結合能を維持したまま容易に欠損な可能なアミノ酸と欠損が難しいアミノ酸の探索に取り組む。次に、欠損が容易なアミノ酸種から２種類を同時に欠損させた改変体を全ての組み合わせで再構成する。同様に、欠損させるアミノ酸を３種、４種と増やすことで、RNA結合活性を持つタンパク質の再構成に必要な最少アミノ酸種類と種類数を明らかにする計画である。
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| Causes of Carryover |
研究開始当初に予定していたよりも順調に研究が進捗したため、消耗品の購入額も当初の見込みよりも大幅に少なくなった。また、プルダウン法に基づく簡便で効率的なタンパク質－RNA分子間相互作用の評価法を開発することができたことも、用品費・消耗品費の支出の抑制につながった。このように、物品費の購入額が当初の見込みよりも少なくなったため、次年度使用額が生じた。
次年度は、本研究計画の遂行に必要な用品費・消耗品費として、さらに、研究成果を学会や誌上発表のための費用に使うことを計画している。
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