2021 Fiscal Year Annual Research Report
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19K22079
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
山口 哲志 東京大学, 先端科学技術研究センター, 准教授 (80398106)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 1細胞解析 / 細胞内膜タンパク質 / GPCR / 光応答性細胞固定化剤 / マイクロ流路 / 細胞内小器官 / 免疫染色法 / 電子顕微鏡観察 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細胞接着剤を塗布したマイクロ流体デバイスを用いて細胞を瞬時に破砕し、直前まで生きていた細胞の細胞膜裏側の表面に直接、自由自在に分子ツールを作用させ、膜近傍の分子システムを単一細胞レベルで定量的に解析する技術を開発する。本年度は、細胞破砕前に細胞を配置し、その表現型を1細胞解析する方法と、破砕後に細胞内の膜タンパク質を1細胞解析する方法を検討した。その中で、接着細胞を基板上に精緻に配置する技術について、論文投稿を行った。
前年度までに、光応答性の細胞配置技術を用いて、細胞の接着表面のサイズや間隔を精緻に制御して細胞を並べ、マイクロ流体のせん断応力を使って細胞を破砕し、細胞内のオルガネラ表面を露出させる技術を開発した。本年度は、破砕前に細胞の動的な形態変化を1細胞解析し、破砕後に細胞内の膜タンパク質のリン酸化を解析することによって、両者の相関を明らかにするワークフローの開発を行った。まず、ロイコトリエンB4（LTB）受容体発現したモデル免疫細胞を、光応答性のPEG脂質修飾表面を用いて捕捉し、種々の濃度のLTBの存在下で細胞の形態変化を観察することにより、受容体シグナルに伴う細胞の運動性の活性化を観察した。次に、細胞破砕後に、LTB受容体の細胞内ドメインのリン酸化を定量する技術を検討した。抗リン酸化抗体とHRP標識二次抗体を用いたEMARS法を用いて、LTB依存的なリン酸化を検出する方法を確立した。また、破砕後に蛍光標識抗体を用いてミトコンドリア表面の膜タンパク質を検出することにも成功し、細胞内オルガネラの膜タンパク質の解析技術も確立した。これらの結果を、化学工学会にて報告した。
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