2020 Fiscal Year Annual Research Report
電子顕微鏡によるタンパク質折り畳み機構の解明：含重原子構造体による構造標識法
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19K22252
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
藤田 大士 京都大学, 高等研究院, 准教授 (20713564)
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2019-06-28 – 2021-03-31
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| Keywords | 自己集合分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題においては、タンパク質の近傍空間を化学構造体により取り囲む、すなわち空間的な修飾を施すアプローチにより、研究計画調書に記載した電子顕微鏡における課題を乗り越える事を目指した。
19年度計画は順調に進捗し、予備検討でも用いていたPdの立方八面体型ケージを用いて、空間的に拘束されたタンパク質の基礎的な振る舞いを核磁気共鳴分光の手法で調査。その結果、空間拘束された酵素は、「天然状態と同様に振る舞い同等の酵素活性を保持している」「天然酵素が凝集沈殿する条件でも凝集沈殿を起こさない」「室温で長期安定保存可能」「拘束空間中にて部分的変性を起こした場合でも、リフォールディング挙動が観測される」といった期待通りの特性を有していることが明らかにした。
しかし同サンプルを用いて低温電子顕微鏡観察を展開したところ、ケージ分子の特性に由来するサンプル調製条件の困難さが浮かび上がった。Pdケージベースのサンプルは、アモルファル氷に包埋する条件にて、グリッドサポートに吸着するように凝集してしまうことがわかった。単粒子解析法を適用するためには、分子同士が適度に分散する条件を探し当てる必要がある。種々の実験条件検討の結果、ケージ分子の生体分子親和性など周辺背景も含め、ケージ分子の設計をスクラッチから見直すことが最良であるという結論に至った。20年度はこの新ケージの設計に取り組み、狙い通りの特性（水溶性、水中における安定性、その他生体分子親和性）の合成に成功した（質量分析法にて確認）。新ケージは合成収率も高く、課題目標の実現に非常に有望であるが、2年間という限られた時間内では上述のタイムロスにより、目的とした「電子顕微鏡を用いたフォールディング機構の解明」までは至らなかった。しかし目標達成のために必要な条件は整い、目標達成にはあと一歩であると考えられるため、課題終了後も引き続き研究を行う予定である。
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