2020 Fiscal Year Research-status Report
加リン酸分解酵素の飛躍的多様化に向けた分子加工法の開発
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19K22263
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
森 春英 北海道大学, 農学研究院, 教授 (80241363)
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2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | 酵素加工 / 加リン酸分解酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖質は，食品用途はじめ，農・医薬・工の幅広い分野で利活用が期待される．糖質は構成糖・結合様式・鎖長の違いにより多様性を示し，これらの利活用には，まずは，個々の糖質の合成が必要である．多彩な糖質の合成に適した酵素種の爆発的増加をもたらす技術として，本研究では，多様な加水分解酵素を加リン酸分解酵素に変換するための分子基盤の理解と技術開発を行う．
昨年度の機能解析により，基質として長鎖オリゴ糖に良く作用し，リン酸存在下で加リン酸分解反応（およびその逆反応）と糖転移反応を触媒する酵素について，変異酵素等の作出および解析を行った．加リン酸分解酵素として必須要素として，リン酸結合に寄与すると予想される3残基に注目した．加リン酸分解活性の全活性に対する比率は，3残基のうち1残基の変異では顕著な変化には至らず，2残基以上の変異により大きく低下した．すなわち，3残基のうち2残基以上がリン酸結合に必須であり，加リン酸分解およびその逆反応において重要であることが明らかとなった．ただし，3残基のうち特定の１残基の変異多数の中に，加リン酸分解活性が完全に消失した変異酵素が得られた．本変異酵素は，加リン酸分解活性（および逆反応の活性）を持たず，しかし野生型では検出限界以下の加水分解活性が検出され，反応条件下で加水分解活性の対全活性比率は90%に達した（残りは転移活性）．導入残基によりリン酸結合が阻害されたものと考えられる．
以上の加リン酸分解の必須要素の解析に加え，本酵素のサブサイト構造の改変，ならびにこれ類似する機能未知の推定タンパク質3種の組換え酵素生産系確立を進めている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
加リン酸分解酵素の必須要素であるリン酸結合残基について変異酵素多数を作出して知見を得た．加リン酸分解活性の消失させてほぼ加水分解酵素活性のみの酵素を創出できた．本酵素の基質結合変異体および類縁酵素の解析も進んでいる．
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| Strategy for Future Research Activity |
本酵素に関しては，比較的長鎖を合成できる酵素機能を活用する観点から，溶解性や安定性を改善する．よりダイナミックな加リン酸分解活性を与えるために，基質結合部位（サブサイト）の改変酵素を多数作出し，潜在性を探りながら機能改変酵素を得たい．既存の加水分解酵素の構造を参考にする．近縁酵素3種について，まずは活性解析を行い，対象を限定しながらリン酸結合，基質糖質結合の知見に基づき機能改変を行う．得られた酵素の新規触媒能を利用した糖質合成反応を行う．条件等検討しながら生成物の変化を解析する．
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