2020 Fiscal Year Research-status Report
イネの標的形質のみを改変できるシス配列探索法の開発
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19K22306
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
犬飼 義明 名古屋大学, 農学国際教育研究センター, 教授 (20377790)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | イネ / 遺伝子発現 / シス配列 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くの遺伝子が複数の器官で共通に発現するため、遺伝子領域中のDNA変異の利用では対象とする器官のみに特化した品種改良が困難である。本研究では、狙った器官の発現パターンのみの改変を可能にする新たなシス配列探索法の開発・検証を試みる。本年度は、既にゲノムワイドにDNA 型が決定されているイネの組換え型自殖系統群を用い、RNA-Seq解析等を通して各遺伝子座の発現量に影響を及ぼすゲノム領域(eQTL)の検出を試みた。
イネ品種TC65、DV85、および両品種を親とするRILs（組換え自殖系統群）を供試材料として用いた。これらを水耕栽培し、各幼植物から根系と葉の両器官をそれぞれ採取してRNAを抽出した。これらのRNAをBrAD-seq法 (Breath Adapter Directional sequencing) (Townsley et al., 2015) によりライブラリーを作成した。その後、各塩基配列を次世代シーケンサーにより解読し、それらのリードをイネゲノムへマッピングした。
その結果、葉では発現しないが、根では両品種間で有意に差がある遺伝子群を選抜した。次に、これら遺伝子群の発現量を制御する染色体領域をexpression QTL（eQTL）解析により検出した結果、最終的に6つのeQTLを見出すことに成功した。このうち、第4染色体上に検出されたeQTLは、遺伝子のプロモーター領域における両品種間の配列の違いによってもたらされる可能性が示唆された。また、根および葉における本遺伝子の発現量をRT-qPCRにより測定したところ、根における発現量は日本型品種よりインド型品種で有意に高く、葉においては両品種ともにほぼ発現していないことが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度は根系のみでなく、地上部器官から採取したRNAを用いてeQTLの検出を試みる予定であったが、サンプルの調製が予想以上に困難であり、そこまでには至らなかった。しかし、予備的な試験を繰り返した結果、昨年度末までに調整の目処がたち、本年度の次世代シーケンサーを用いた解析へとスムーズに以降することが可能であった。しかし、その分、本年度の実験の進行に影響が出たため、「やや遅れている」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. eQTLを見出した遺伝子座に注目し、日本型、およびインド型品種間においてプロモーター配列を比較しする。
2. 両品種由来の異なる長さのプロモーター領域とレポーター遺伝子を連結し、これらを導入した形質転換体を作成する。
3. これらのレポーター遺伝子の発現量を比較し、両品種間の遺伝子発現量の違いをもたらす候補領域を絞り込む。
4. 選抜された候補シス配列をゲノム編集技術により破壊し、発現量制御への関与を検証する。
以上により、器官特異的な発現量制御を可能にするシス配列の同定を試みる。
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| Causes of Carryover |
昨年度は根系のみでなく、地上部器官から採取したRNAを用いてeQTLの検出を試みる予定であったが、サンプルの調製が予想以上に困難であり、そこまでには至らなかった。しかし、予備的な試験を繰り返した結果、昨年度末までに調整の目処がたち、本年度の次世代シーケンサーを用いた解析へとスムーズに以降することが可能であった。しかし、その分、本年度の実験の進行に影響が出たため、計画した実験を全て修了するには至らなかった。そのため、次年度使用額が発生する結果となった。
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